樟树叶精油组成分析及抗氧化活性研究

李嘉欣，孟斌斌，朱 凯*

(1.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037; 2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037)

樟树是樟科樟属植物中经济价值较高的树种之一,主要分布于中国南方各省的亚热带。从樟树叶中提取的挥发性精油富含芳樟醇、 1,8-桉叶油素、樟脑、异-橙花叔醇和龙脑等重要天然成分[1]，且具有芳香、医疗和驱虫等作用而成为医药卫生、化工、食品、香料的重要原料。此外，樟树叶为可再生资源，其应用前景广阔[2]。根据樟树枝叶精油中所含主成分的不同，可将樟树分为脑樟(主要含有樟脑)、芳樟(芳樟醇)、油樟(桉油素)、异樟(异-橙花叔醇)和龙脑樟(右旋龙脑)等5种化学类型[3-4]。生物体在自然代谢过程中均会产生自由基，自由基及其引发的氧化反应，会加快食品氧化、加速人体衰老[5]，甚至还可能造成一系列疾病，如癌症、糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病和炎症[6-7]。因此，通过对体内外自由基的清除，能够起到延长食品保质期、延缓人体衰老、减少疾病的作用。目前，在食品、医药等领域大多使用合成的抗氧化剂，如Vc、丁基羟基茴香醚(BHA)和没食子酸丙酯(PG)等[8]。这些合成的抗氧化剂都有一定的毒副作用，会造成或多或少的不利影响，长期服用，可能会对身体健康造成危害[9]。近年来，氧化应激对人体健康的影响已经被越来越多的人关注，人们更希望寻找绿色、天然、健康的抗氧化剂来代替合成的抗氧化剂[10-11]。迄今为止，很多植物的精油都含有丰富多样的抗氧化活性成分，而精油含量丰富的芳香植物原料则成为目前研究的重点[12]。目前，对于不同化学类型樟树精油的成分分析及抗氧化活性方面的研究很少，基于此，本研究采用GC-MS对异樟、脑樟、油樟和芳樟4种樟树叶精油的化学组成进行分析，并研究其成分差异和体外抗氧化活性，以期为樟树资源高效高质的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

新鲜樟树叶片于2019年2月采自南京林业大学校园内，樟树叶分别摘自4种樟树(芳樟、脑樟、异樟和油樟)，自然风干，粉碎，备用。

TRACE 1300-ISQ型气相-质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 樟叶精油的提取

分别称取100 g经粉碎的4种樟树叶片，装入1 000 mL四口烧瓶中，蒸馏水的料液比为1 ∶8(g ∶mL)，水蒸气蒸馏5 h，待冷却后用乙醚萃取，并分离后得到精油，置于4 ℃下保存待用。

1.3 GC-MS分析

色谱条件：色谱柱DB-5MS；初温68 ℃，以15 ℃/min升温至150 ℃，然后以5 ℃/min升温至200 ℃，再以15 ℃/min升温至280 ℃，进样口温度为250 ℃。FID检测器温度为280 ℃；0.1 μL进样量，载气为氦气。采用面积归一法确定各化学组分的相对质量分数。

质谱条件： EI离子源250 ℃，四级杆150 ℃；电子能量70eV；电子倍增管电压1 347 V，扫描质量范围45～450 u。

1.4 樟叶精油抗氧化活性测定

1.4.1DPPH自由基清除能力测定 DPPH自由基(DPPH·)在有机溶剂中较为稳定，溶于乙醇呈紫色，在517 nm附近有强吸收。向DPPH溶液中加入抗氧化剂时，DPPH的单电子被配对，在517 nm处的吸光光度变小，颜色变浅，且颜色越浅说明所加入的抗氧剂对DPPH·的清除能力越强[13]。因此，可通过测定样品在在517 nm处的吸光度值来判定其抗氧化能力。

称取3.94 mg(0.01 mmol)DPPH，用无水乙醇溶解，配制成0.1 mmol/L 的DPPH乙醇溶液，贮存于棕色容量瓶中，并置于暗处备用。将4种化学类型樟树叶精油样品分别溶于无水乙醇中，配置成质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L的精油溶液。分别取不同质量浓度的精油溶液2 mL，加入 2 mL 配好的DPPH溶液，摇匀后，置于暗处反应30 min，测定其在波长517 nm处的吸光度值，记为A1；用2 mL 无水乙醇代替样品液作为对照组，测定其在波长517 nm处的吸光度值，记为A0。每组重复3次，取平均值,按以下公式计算DPPH·清除率：

y=(A0-A1)/A0×100%

式中：y—DPPH自由基清除率，%；A1—加入DPPH的精油溶液吸光度值；A0—加入DPPH的无水乙醇吸光度值。

1.4.2ABTS自由基清除能力测定 配好的ABTS溶液呈墨绿色，向其中加入抗氧化剂后，ABTS自由基(·ABTS+)的产生会被抑制，使在最大吸收波长734 nm处测得的吸光度值随氧化剂氧化能力的增强而减小[14]，从而计算出样品的抗氧化能力。

式中：y—ABTS自由基清除率，%;A′1—加入·ABTS+的精油溶液吸光光度值;A′0—加入·ABTS+的无水乙醇吸光光度值。

1.4.3总抗氧化能力测定 FRAP法是以氧化还原反应为基础，在酸性条件下，Fe3+与三吡啶基三嗪(TPTZ)形成复合物(Fe3+-TPTZ)，当加入抗氧化剂时，形成的复合物被还原为二价铁而变为蓝色，且在其最大吸收波长593 nm处的吸光度值减小[15]。因此，可以将此法作为测定样品总抗氧化能力的一种方法。精油的总抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP=1 mmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的浓度。

分别取不同质量浓度的FeSO4溶液0.1 mL，各加入2.9 mL TPTZ工作液，37 ℃ 下反应10 min，测定其在波长为593 nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，FeSO4质量浓度为横坐标绘制标准曲线，曲线方程为Y=0.350 2+0.906 6X,R2=0.994 9。

分别取0.2 mL质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L 的精油溶液于5 mL离心管中，加入 3.8 mL TPTZ 工作液(0.3 mol/L 醋酸盐缓冲液，10 mmol/L TPTZ 溶液，20 mmol/L FeCl3溶液以V(醋酸盐缓冲液) ∶V(TPTZ溶液) ∶V(FeCl3溶液)=10 ∶1 ∶1混合，现用现配)，37 ℃下反应10 min，测定其在波长为593 nm 处的吸光度。每组重复3次，取平均值。通过FeSO4标准曲线，分别得到4种不同化学类型樟树叶精油的FRAP值。

2 结果与分析

2.1 樟树叶精油成分分析结果

采用GC-MS对不同化学类型樟树叶精油化学组成进行分析，GC-MS分析总离子流色谱图见图1。

a.芳樟linalool; b.脑樟camphor; c.异樟isonerolidol; d.油樟cineol

按峰面积归一化法计算各组分的质量分数，经计算机标准谱图库检索对比，同时参考有关文献进行人工检索，确定精油中的化合物组成，分析结果见表1。

表1 不同化学型樟叶油的化学组分

表1为不同樟树叶精油的GC-MS分析结果，4种樟树叶精油共检测出46种主要化学成分，其中，共有的主要化学成分有24种，包括萜烯类15种、醇类5种。另外，有10种成分只在2种精油中被检测到，有12种成分只在1种精油中被检测到。

芳樟叶精油中共鉴定出33种化合物，占总挥发性物质的97.47%，其中，萜烯类17种(13.88%)，醇类10种(80.40%)，精油主要成分为芳樟醇(71.91%)、牛儿烯(4.24%)、3-辛烯-2-醇(4.22%)等；脑樟叶精油中共鉴定出33种化合物，占总挥发性物质的97.33%，其中，萜烯类20种(37.38%)，醇类8种(53.34%)，精油主要成分为樟脑(46.28%)、α-蒎烯(7.19%)、(+)-柠檬烯(5.18%)；异樟叶精油中共鉴定出35种化合物，占总挥发性物质的94.19%，其中，萜烯类18种(25.05%)，醇类10种(56.90%)，精油主要成分为异橙花叔醇(29.48%)、桉油烯醇(11.42%)、芳樟醇(10.97%)、蒿酮(9.70%)，其中蒿酮为异樟叶精油中独有的成分，且含量较高；油樟叶精油中共鉴定出33种化合物，其占总挥发性物质的97.30%，其中萜烯类18种(42.9%)，醇类9种(23.64%)，精油主要成分为：1,8-桉叶油素(30.31%)、桧烯(15.52%)、α-松油醇(11.27%)、α-蒎烯(6.09%)，其中桧烯和α-松油醇的含量明显高于其它几种精油。可见，异樟叶精油中所检测到的主要化学成分种类最多，芳樟叶精油中醇类物质含量最高，油樟叶精油中萜烯类物质含量最高。

2.2 樟树叶精油的抗氧化活性

2.2.1DPPH自由基清除能力 4种樟树叶精油的DPPH自由基清除能力比较如表2所示，4种精油的DPPH自由基清除能力均与浓度呈现出正相关的关系。

表2 不同樟树叶精油的DPPH·和·ABTS+清除能力

从表中数据可以看出，4种樟树叶精油都具有一定的DPPH自由基清除能力，并且随着精油质量浓度的增加，精油的DPPH自由基清除率逐渐增加。4种精油中，脑樟叶精油的DPPH自由基清除能力最强，当质量浓度为8 g/L时，脑樟叶精油的DPPH自由基清除率达到30.34%±1.25%；当精油质量浓度为0.5～4 g/L时，4种精油清除DPPH自由基能力大小顺序为：脑樟叶精油>油樟叶精油>芳樟叶精油> 异樟叶精油，但当精油质量浓度为8 g/L时油樟叶精油清除DPPH自由基能力低于芳樟叶精油。BHA在较低质量浓度(1 g/L)下自由基清除率为81.20%±0.75%，明显好于樟树精油。

2.2.2ABTS自由基清除能力 4种樟树叶精油的ABTS自由基(·ABTS+)清除能力亦见表2，由数据可知4种精油的·ABTS+清除能力均与浓度呈现出正相关的关系。

从数据可以看出，4种樟树叶精油都具有一定的·ABTS+清除能力，并且随着精油浓度的增加，精油的·ABTS+清除率逐渐增加。4种精油中，异樟叶精油的·ABTS+清除能力最强，当质量浓度为8 g/L时，异樟叶精油的·ABTS+清除率达到14.93%±2.32%。4种樟树叶精油清除·ABTS+能力顺序为：异樟叶精油>脑樟叶精油>芳樟叶精油>油樟叶精油。此外，随着精油浓度的增加，异樟叶精油和脑樟叶精油的·ABTS+清除率增长速度明显大于芳樟叶精油和油樟叶精油。对于·ABTS+，BHA在4 g/L的浓度下，自由基清除率为90.02%±0.06%，相同浓度下，异樟叶油的清除率为9.43%±0.43%。

2.2.3总抗氧化能力(FRAP) 根据FeSO4标准曲线(图1)得到4种樟树叶精油抗氧化能力与精油浓度关系如图2所示。

图2 不同樟树叶精油对Fe3+的还原能力Fig.2 Fe3+ reduction ability of four essential oils

从图2中可以看出，4种樟树叶精油均具有一定的Fe3+还原能力，并且，随着精油浓度的增加，对Fe3+的还原能力也逐渐增加。4种精油中，脑樟的Fe3+还原能力相对较强，只在浓度为4 g/L时，Fe3+还原能力略低于异樟精油，当精油为8 g/L时，FRAP值达到(1.44±0.13)mmol/L，表现出较强的抗氧化能力。当精油为0.5～4 g/L时，异樟叶精油的FRAP值与脑樟叶精油的FRAP值相近；当精油为8 g/L时，异樟叶精油的FRAP值为(1.18±0.11)mmol/L，也具有较强的抗氧化能力。油樟叶精油与芳樟叶精油的FRAP值相近，当精油质量浓度为8 g/L时，FRAP值分别为(0.51±0.31)mmol/L和(0.52±0.24)mmol/L，抗氧化能力相对较弱。因此，4种精油总抗氧化能力顺序为：脑樟叶精油>异樟叶精油>芳樟叶精油/油樟叶精油。

与BHA相比，4种不同类的樟树精油综合抗氧活性明显不如BHA，但植物精油为天然物质，具有绿色、清洁环保的优势，所以此研究预计有很好应用前景。

目前，研究人员进行了大量关于抗氧化作用机制的研究发现，植物精油的抗氧化活性多与其丰富的酚类及萜类物质有关[16-18]。而樟叶精油中虽几乎不含有酚类物质，但其富含萜烯类化合物，因此具有良好的抗氧化活性。由于樟叶精油中化学成分组成复杂，因此其抗氧化作用机理还有待进一步的研究。

3 结 论

3.1采用GC-MS分析鉴定樟树叶精油成分，4种樟树叶精油共检测出46种主要化学成分，萜烯类占主要部分。芳樟叶精油中共鉴定出33种化合物，占总挥发性物质的97.47%，其中，主要成分芳樟醇为71.91%，萜烯类17种(13.88%)，醇类10种(80.40%)；脑樟叶精油中共鉴定出33种化合物，占总挥发性物质的97.33%，其中，主要成分樟脑为46.28%，萜烯类20种(37.38%)，醇类8种(53.34%)；异樟叶精油中共鉴定出35种化合物，占总挥发性物质的94.19%，其中，主要成分异橙花叔醇为29.48%，萜烯类18种(25.05%)，醇类10种(56.90%)；油樟叶精油中共鉴定出33种化合物，占总挥发性物质的97.30%，其中，主要成分1,8-桉叶油素为30.31%，萜烯类18种(42.9%)，醇类9种(23.64%)。

3.24种樟树叶精油对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力及总抗氧化能力的结果表明：4种精油均具有一定的抗氧化能力，且随精油浓度的增加，其抗氧化能力增强。其中，脑樟叶精油的DPPH自由基清除能力及Fe3+还原能力最强，当质量浓度为8 g/L时，脑樟叶精油的DPPH自由基清除率为30.34%±1.25%，FRAP值为(1.44±0.13)mmol/L；而异樟叶精油的ABTS自由基清除能力最强，当质量浓度为8 g/L时，异樟叶精油的ABTS自由基清除率为14.93%±2.32%。