miRNA-200s介导SEC23A调节的分泌蛋白组对慢性阻塞性肺疾病（COPD）EMT的影响及机制研究

朱敏 陆建萍 高静 来依宁 吴叶菊,卡米拉 黄丽欢

摘要： 目的  探讨miRNA-200s介导的SEC23A调节的分泌蛋白组对EMT的影响及机制。方法  荧光报告系统检测在气道上皮细胞中，miRNA-200s是否通过结合3′ UTR而调节SEC23A的表达。WS刺激Rat AECs和16HBE，使miRNA-200s过表达或者低表达，运用荧光共聚焦， RT-PCR，Western blot 和Sircol assay检测SEC23A和Col I的表达变化。另外，使SEC23A过表达或者siRNA，观察是否出现EMT的改变。运用荧光共聚焦， RT-PCR，Western blot 和Sircol assay检测Col I的表达变化。结论  在COPD的SAR发生发展中，miRNA-200c可以靶向调节SEC23A介导的Collagen I分泌，这种分子调节进而对EMT产生影响，该过程将成为SAR发生分子机制的一条新型信号途径，可能成为COPD治疗的一个有效干预靶点。

关键词：miRNA-200s  SEC23A  慢性阻塞性肺疾病（COPD） EMT

【中图分类号】R322.3                     【文献标识码】A                      【文章编号】2107-2306（2020）01-092-01

在COPD的发生发展过程中，小气道重塑（Small Airway Remolding， SAR）形成是COPD气流阻塞的主要病理学基础，是COPD病变持续发展的关键因素【1】。本文旨在探讨miRNA-200s介导的SEC23A调节的分泌蛋白组对EMT的影响及机制，研究如下：

（1）研究内容

探讨miRNA-200s介导的SEC23A调节的分泌蛋白组对EMT的影响及机制。

（2）研究目标

①明确参与SAR的miRNA-200s亚型，探讨该亚型以及SEC23A表达改变，及其与SAR的相关性。

②探讨miRNA-200s通过对SEC23A介导的分泌蛋白组的靶向调节对EMT的影响和分子机制，评估该新型信号途径是否可能成为COPD治疗的一个有效干预靶点。

（3）拟解决的关键科学问题

①明确miRNA-200s在SAR发生发展中的作用，鉴定新的参与调节SAR发生发展的关键靶基因和通路。

②阐明miRNA-200s通过对SEC23A介导的分泌蛋白组的靶向调节对EMT的影响和分子机制。

（4）实验结果

实验结果一：

①首先采用Targetscan软件分析结果显示，miRNA-200s含有和Sec23a基因的3UTR结合的保守位点。

②构建SEC23A 3UTR荧光素酶报告基因质粒（野生型和突变型），与miRNA-200c 模拟物共转染，荧光报告系统检测荧光素酶的活性，荧光素酶报告基因实验结果证实，共转染野生型SEC23A 3UTR荧光素酶质粒和pre-miRNA-200c，与其他各组相比，荧光素酶活性明显降低，差异有统计学意义，P<0.01。

实验结果二：

①SEC23A对Collagen I分泌的调节：在Sec23a基因敲除的胚胎间充质细胞中转染SEC23A-GFP使SEC23A过表达，结果显示过表达SEC23A的细胞可以促进Collagen I分泌到细胞外，呈现典型的纤维丝状结构。而没有过表达SEC23A细胞则使Collagen I不能分泌出细胞。在培养的胚胎成纤维细胞中，正常成纤维细胞可以将Collagen I分泌到细胞外呈纤维状，而完全敲除Sec23a基因则导致分泌到细胞外的Collagen I减少，细胞间隙完全没有Collagen I沉积。Sec23a敲除导致Collagen I分泌减少负反馈调节引起Collagen I合成进一步减少。

②SEC23A表达改变对EMT的影响：WSC刺激16HBE，使SEC23A过表达或者siRNA，蛋白印迹结果显示SEC23AsiRNA促进细胞上皮型标记蛋白E-cat表达上调，间质型标记蛋白Vimentin表达下调，说明SEC23AsiRNA抑制EMT现象的发生，上皮表型转化成纤维细胞样的间质表型减少，从而促进Collagen I的分泌减少，而SEC23A过表达促进EMT发生，Collagen I的分泌增加。

讨论

Col I的蛋白合成后转入到内质网（endoplasmic reticulum，ER），经过正确折叠的蛋白经过COPII（Coat protein complex II ，COPII）转运到高尔基体进行进一步修飾，最终分泌到细胞外。COPII由SAR1，SEC23–SEC24复合体，以及SEC13–SEC31复合体五种成分组成，负责将大部分分泌蛋白从ER转运到高尔基体。SEC23在COPII中发挥关键性作用，分为SEC23A和SEC23B两个亚型。其中SEC23A可以加速细胞外基质蛋白从ER到高尔基体的转运，担负着这些蛋白的分泌和合成的功能【2】。我们结合前期实验和研究进展，推测SEC23A可能通过介导Col I 的合成和分泌，进而调节EMT，从而在COPD的SAR中发挥重要作用。miRNAs调节很多分子和细胞过程。异常miRNAs表达可以导致很多病理性疾病的发生和发展。特别是miRNA-200s可以特异性抑制SEC23A的表达，进而调节SEC23A介导的分泌蛋白组（Secretome），在乳腺肿瘤的转移中发挥重要作用【3】。基于TGF-beta刺激肺泡上皮形成的肺纤维化模型中miRNA-200s下调，Sec23a表达明显上调，我们推测在COPD的SAR发生发展过程中，miRNA-200s可能调控SEC23A的表达。结论，在COPD的SAR发生发展中，miRNA-200c可以靶向调节SEC23A介导的Collagen I分泌，这种分子调节进而对EMT产生影响，该过程将成为SAR发生分子机制的一条新型信号途径，可能成为COPD治疗的一个有效干预靶点。

该项目获得新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目（项目编号：2016D01A020）支持

参考文献：

[1]Hogg JC， Chu F， Utokaparch S， Woods R， Elliott WM， et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. New England Journal of Medicine2004; 350： 2645–2653.

[2]Ishikura-Kinoshita S， Saeki H， Tsuji-Naito K. BBF2H7-mediated Sec23A pathway is required for endoplasmic reticulum-to-Golgi trafficking in dermal fibroblasts to promote collagen synthesis J Invest Dermatol 2012， 132：2010–2018.

[3]Korpal M1， Ell BJ， Buffa FM， Ibrahim T， Blanco MA， Celià-Terrassa T， Mercatali L， Khan Z， Goodarzi H， Hua Y， Wei Y， Hu G， Garcia BA， Ragoussis J， Amadori D， Harris AL， Kang Y. Direct targeting of Sec23a by miR-200s influences cancer cell secretome and promotes metastatic colonization. Nat Med. 2011 Aug 7;17（9）：1101-8.

作者简介：

朱敏（1978.8）女;汉族，湖北武汉，主任医师，博士;研究方向：呼吸与消化病理及精准医疗。