ImageJ软件在医学科研领域中的应用研究现况＊

黎 晨，尤培蒙，皮启星，王晨曦，何俊霞，肖文媛，拜思琼，赵 晋

（西北民族大学医学院，甘肃 兰州 730030）

图像分析在许多生命科学领域，特别是医学科研领域方面是非常重要的。一组好的数据是得到一个满意的实验结果的必要组成部分。目前，数据图像的数量正呈指数级增长，且图像的视觉检测和人工测量是一项耗时的任务，缺乏灵敏度、准确性、客观性和可重复性[1]。所以，为了避免人为的选择偏倚和测量偏倚，提高数据准确性与实验的客观性，研究人员迫切需要某种软件来提供自动或半自动的成像技术。

ImageJ是一款由Bethesda，MD于美国国立卫生研究院（NIH）研发的基于Java的公共免费图像处理和分析程序[2]，可运行于Windows、Mac OS和Linux系统，其本身可以对图像进行像素焦点计数和大小定义，并正确的计数重合焦点，还能测量每个单独焦点的综合光密度（IOD），且支持图像栈功能，即在一个窗口里以多线程的形式层叠多个图像，并行处理等等功能决定了ImageJ软件可进行细胞焦点计数分析、面积百分比的比较与测定、3D图像特征量化分析、细胞和生物体共定位、组织形态分析、血管相关密度分析等图像量化分析功能。ImageJ作为一个开源软件，拥有大量免费插件[4]，它可以被自由地检查、修改和重新开发[5]，不但可提高图像分辨率与清晰度，还可根据需要功能安装相应的插件。用户亦可利用Java平台进行编程用来开发目前缺少的适用插件，来满足当前需要的功能。由于该软件具备的强大功能，所以ImageJ软件广泛应用于国外的医学研究领域与其他研究领域中。

1 应用领域

1.1 细胞焦点计数与分析

为了评估冷冻消融前后的T细胞浸润情况，Cerqueira MA等[6]使用ImageJ软件进行CD4+/CD8+比值的定量分析，并可比较Diag+、Diag-、Cryo+和Cryo-之间的差异。除细胞外，Bera T等[7]用ImageJ与传统技术如光密度、流式细胞技术和qPCR进行验证，发现该软件可根据不同微生物的进行定制，以估计不同的病原体。该方法还可以检测～100细菌cfu/mL或通过增加成像和计算时间估计更低的浓度。

1.2 面积与面积百分比

使用ImageJ比较紧张和松弛状态下的肛提肌扩张容积，测量提上睑裂孔(LH)和泌尿生殖道裂孔(UGH)和矢状面中部面积，结合t检验、效应大小和Pearson相关系数进行测量比较显示该结果具有统计学意义[3]。Abou Eitta RS等[8]用ImageJ测量采用两种方式治疗痤疮疤痕后显示瘢痕面积百分比明显下降，结果表明两只治疗方法均有效，但两种治疗方法疗效差异并不显著。

1.3 3D图像特征量化分析

对3D图像的测定与分析一直是医学研究中的一大难题，一方面不能确保数据的准确性，另一方面数据的不完整性都是是需要克服的问题。Erguvan等[9]在ImageJ中研发了一个宏SurfCut用于提取表皮细胞轮廓信号，允许从3D共聚焦堆栈中提取细胞轮廓。其次，通过ImageJ软件自带的3D图像分析功能，Ayuso-Montero R[10]通过对口腔3D表面扫描进行咬合接触面（OCA）评估，与T扫描相比较，通过组内相关系数（ICC）评定，发现相较于3D扫描，T扫描测量OCA的方法更为可靠。“DiAna”：一个ImageJ附加程序[11]，可自动对对象进行协同定位和距离分析并提供对物体之间的协同定位的深入分析，检索3D测量包括共同定位体积和接触表面。

1.4 蛋白定位与共定位

蛋白定位分析大多来自于多通道、高分辨率、荧光显微图像且常为大量数据。ImageJ则提供了简单、可定制和可重现的多通量化分析的方法[12]。Escorcia W等[13]将软件应用于活细胞成像技术，并根据数据分析评估了蛋白质运动、定位、稳定性和计时以及核动力学和染色体分离，将其结果与普通显微镜方法进行比较。软件里包含的“Coli-Inspector”功能支持自动和交互方法的组合，是可以完全控制图像分析和数据收集的方法，并使用目视检查工具快速消除伪影。能根据细胞分裂周期、细胞年龄对细胞进行分类，并分析每个蛋白的空间定位模式[14]。

1.5 组织形态分析

组织学研究的主要部分是使用高分辨率成像进行数据收集和分析，使用ImageJ是从高分辨率横断面图像测量皮质骨区域的半自动方法[15]。Shukla S等[16]建立小鼠角膜损伤模型，通过ImageJ计算评分角膜混浊程度，评估了不同的给药方式(局部，结膜下，腹腔内和静脉注射)促进组织修复和恢复角膜透明性的效果。

1.6 血管相关密度分析

光学相干断层血管造影（OCT-A）用于评估血管与微血管的变化情况，ImageJ可用于测量不同OCT-A扫描的糖尿病患者血管与灌注密度改变，根据结果比较哪种扫描方式更具代表性[17]以及评价滤过手术前后结膜血管生成的变化，进行滤过性手术的成功程度相关性分析[18]。

1.7 ImageJ与其他工具软件结合比较

1.7.1 ImageJ与Photoshop

通过灰度直方图分析，使用组内相关系数(ICCs)和测量的标准误差(SEM)来评价和比较Photoshop和ImageJ用于老年人肌肉组织回声的可靠性[19]。结果显示两款软件的结果无明显差异，但与Photoshop和ImageJ一起使用的ROI选择方法更适用于老年人组织回声的采集后图像分析。McKenzie等[20]将ImageJ与Photoshop结合进行了母鸡卵泡尿囊膜(HET-CAM)试验，通过检测对微小血管的损伤量化新型凝胶制剂的刺激性潜力，结果表明该药物对眼组织无刺激性。在横断面研究里，Lim HW等[21]测量下斜肌过度活动的程度，用Photoshop对图像进行处理，ImageJ进行分析结合相关系数的计算与回归评估，得出结果1级、2级、3级和4级的下斜肌过度动作的平均角度分别为 10.5±9.1°、16.8±7.8°、24.3±8.8°和 40.0±12.2°(P<0.001)。

1.7.2 ImageJ与Slice-O-Matic

Irving BA等用此两款软件分析了腹部脂肪组织的横截面积。Bland-Altman分析表明[22]ImageJ与Slice-O-Matic的结果具有可比性。测量间的变异系数分别为0.9%～4.8%和0.2%～2.6%，获得的aVF横截面积之间平均差异的95%置信区间为(-5.7，+10.8 cm)。提示该两款软件并无明显差异，其结果都提供了对脂肪组织和骨骼肌横截面积的可靠测量并具有统计学意义。

2 插件

2.1 软件研究现况

在新兴科学的需求下对ImageJ的发展提出了相应的挑战。很多实验结果的分析应用原生的ImageJ已经不足以满足实验的需求，这迫使研究人员们另辟新径，不断改进和完善ImageJ的生态系统和功能。于是，为了满足各种不同实验要求的各式插件也就相继而生。不过并不是所有的插件都是可用于实验结果的分析，下面结合了各大搜索引擎（中国知网、万方、PubMed、GeenMedical、SCI（科学引文索引）数据库）的检索结果后，简单罗列了几个目前功能相对完善，结果分析较准确的ImageJ插件。

2.2 相关插件

2.2.1 Custom Macros

“Custom Macros”插件自动和系统化了神经组织图像分析中的用户交互功能，包括区域选择和阈值、点/对象计数、面积测量、批量过滤处理和数据审查。在进行多个神经化学探针的神经组织成像实验和覆盖不同脑区的实验时可用于分析和处理数百张显微图像组成的结果数据集[23]。

2.2.2 AxonTracer

脊髓组织切片中轴突的数量级靠人工计数难以量化分析，于是Patel A等[24]开发了一款名为“AxonTracer”的插件，旨在弥补ImageJ在量化计数轴突时的不足，用于自动分析受损神经系统中再生的轴突。该插件可根据免疫组织学染色识别移植细胞、移植物或其他阳性区域(ROI)，并对ROI内的再生轴突进行跟踪量化。

2.2.3 Cell Concentration Calculator(CCC)与Transwell Counter

在用ImageJ计数细胞时，有时可因为图像上的色差，杂质和板块等异物以及背景颜色的影响而产生不同程度上结果的偏差[25]。“CCC”与“Transwell Counter”结合使用可在最小背景下获取高质量缩微图，用于快速计数和分析大样本大小，内置分析工具帮助校准计数。前者用于图像体积校正，后者用于图像采集与平场。此插件仅适用于自动血细胞分析仪(或已知体积)和迁移/侵袭细胞计数[26]。然而由于细胞计数时的不可控因素太多，再好的插件也只能降低偏差的发生，不能做到完全准确的程度。所以在计数细胞时，图像的饱和度、对比度、亮度、增益、平均锐度仍需要凭借经验来满足最佳计数条件。

2.2.4 SarcOptiM

SarcOptiM包括一个心肌细胞收缩的模拟器和视频发生器用来采集参数。可以实时或离线工作，后者能克服旋转运动或与位移相关的伪影[27]，如对ImageJ中捕获或显示的视频帧进行傅里叶变换分析来计算肉瘤长度，从而允许实时或离线测量肉瘤长度[28]。此插件主要用来测量肌节长度，评估心肌细胞的收缩功能。

2.2.5 QuantIF

为了定量测定病毒感染的免疫荧光蛋白表达，Handala L等[29]开发了一个 ImageJ宏插件“QuantIF”，使用DAPI和Specific-染色法自动确定来自同一场的两个图像的细胞总数和标记细胞数，可自动分析数个图像，每幅图约需一秒。

2.2.6 NucleusJ

该插件专门用于在3D中表征核形态和染色质组织。从图像堆栈开始，将Otsu分割方法与核球度优化相结合，确定核边界。染色质结构域通过使用3D分水岭算法分割细胞核并通过在结果区域上阈值对比度测量来分割。输出时，NucleusJ量化了15个参数，包括核的形状和大小以及核内物体及其在核内的位置[30]。

3 结语

ImageJ软件虽然功能强大，应用范围广，但想要得到期望的结果必须是在正确使用该软件及其插件作为前提。在确保软件操作规范后，ImageJ软件的量化数据既可作为终点指标直接对结果进行说明与判定，也可当作中间指标作为后续分析检验的数据来源，亦或是作为辅助数据，从侧面衬托最终结果的可靠性与可信度。值得提出的是，使用ImageJ软件分析都有一个共同点，就是其结果必须进行检验或回归分析等，并判断有无临床意义，因为此软件的应用仅为客观的量化数据分析结果，最大限度上避免了人工分析或计数检测的主观性对实验造成的偏差，也就是说，ImageJ软件提供了一个对实验进行的测定分析的平台，其得出的数据可靠性还需做后续检验，进行比较，来确定测定数据的可用性程度。

ImageJ软件仍有许多已知和未知的功能，或是经过验证或是仍处于验证阶段，国内的研究人员对结果的测量可以倾向于对该软件的验证与开发，从而加快实验进程、提高实验科学性、为临床科研提供参考。