丁酸梭菌发酵龙眼多糖的工艺优化及多糖含量变化

向 蓉，梁伟杰，袁明贵，彭新宇，余丹妮，徐志宏，康桦华

（广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东广州 510640）

目前微生态制剂已广泛应用，也是畜牧养殖业中重要的抗生素替代品。相对于抗生素，微生态制剂是无残留、无毒、无污染的安全环保产品[1-2]。中药中的天然活性物质成分复杂，传统的炮制方法难以将药效发挥到最佳[3]。近年越来越多的研究表明，利用微生物对中药或其活性物质进行发酵可以使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解，从而减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，可提高有效成分提取率，达到增强药效或者产生新的药效的作用[4-6]。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）别名为酪酸菌，是在土壤和10%～20%的健康人粪便中发现的产生丁酸的专性厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌[7]，农业农村部（原农业部）已于2009 年批准丁酸梭菌作为断奶仔猪和肉仔鸡的饲料添加剂，因此探索高效的丁酸梭菌发酵工艺用以制备高活性的丁酸梭菌制剂具有重要意义。龙眼是国家卫生健康委员会官方批准的“药食同源”食物之一，龙眼多糖是龙眼肉的主要生物活性成分，具有增强自由基的清除、增强机体免疫力以及促进肠道有益菌增长等诸多生物功能[8]。龙眼是广东名特稀有水果，其果实深受人们喜爱，但在食用或加工过程中会产生大量龙眼碎肉等边角料副产品，这些边角料副产品的营养价值和活性成分不低于正常果肉，但通常是直接丢弃，既浪费资源，又不利于环境保护。因此，本试验旨在研究丁酸梭菌液体发酵龙眼多糖的最佳发酵工艺参数，并探明发酵液中总多糖含量的变化情况，为生产安全、高效、无残留的富含多糖的丁酸梭菌微生态制剂奠定理论基础，为龙眼加工废弃物的资源化再利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 丁酸梭菌（GIMCC GIM1.676）购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。龙眼干为广东省高州市“鸡眼”品种经干制后加工而成。梭菌增菌培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司。纤维素酶（Avicel®PH-101）为Sigma 公司产品；苯酚、浓硫酸为广州化学试剂厂生产；无水乙醇为南京化学试剂股份有限公司生产；无水葡萄糖为上海伯奥生物科技有限公司产品；液体石蜡为江苏强盛功能化学股份有限公司产品。

主要仪器与设备包括XS-205DU 十万分之一天平（广州三元科技有限公司）、pHS-3C 数显pH 计（上海精密科学仪器有限公司）、HH-4 数显恒温水浴锅（常州奥华仪器有限公司）、RE 5299 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、UV-3100PC 紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、LRH-150F 生化培养箱（上海恒科学仪器有限公司）、多功能微生物培养系统（广州市尤德生物科技有限公司）。

1.2 龙眼多糖的提取 称取适量龙眼果肉匀浆，参照贺寅等[9]优化的酶法工艺条件提取龙眼多糖，即纤维素酶添加量为1.2%（w/w）、液料比为15:1、温度为45.0℃、时间为187.0 min，在120 r/min 摇床上进行提取试验。提取结束后80℃水浴灭酶10 min。用8 层纱布过滤掉龙眼果肉残渣后将所得液体通过旋转蒸发仪进行浓缩，获得龙眼多糖提取液。

1.3 龙眼多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[10-11]测定龙眼多糖含量。

标准曲线制作：精确地称量干燥的葡萄糖100.00 mg，用去离子水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，得到1 mg/mL葡萄糖标准液。用移液枪分别吸取0、100、200、300、400、500、600 μL 的葡萄糖标准液（1 mg/mL）于10 mL容量瓶中定容，摇匀，得到不同浓度（0、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的葡萄糖标准溶液。依次移取上述不同浓度的标准溶液2.0 mL 于10 mL 试管中，用移液枪依次加入1.0 mL 预先配好的6% 苯酚溶液，摇匀，再用移液管依次加入5.0 mL 浓硫酸，盖上胶塞，摇匀后放入沸水浴中加热25 min，再放入冷水浴中，直至冷却至室温，用紫外分光光度计在490 nm 处测定待测样品的吸光度。以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标、以每个浓度相对应的吸光度（A）为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程，即标准曲线（图1）。

龙眼多糖提取物中多糖含量测定采用上述苯酚-硫酸法，测得的吸光度值带入标准曲线中计算多糖含量。

1.4 细菌的培养和计数 菌种活化后，接种于梭菌增菌液体培养基，加入适量的液体石蜡液封后放入生化培养箱中，37℃下恒温培养24 h。

活菌计数采用平板菌落计数法。将琼脂粉按2%比例加至梭菌增菌培养基中配置成计数平板。吸取发酵液1 mL，经10 倍梯度稀释后，吸取10-4、10-52 个梯度的稀释液100 μL 进行涂板，平板置厌氧罐中经多功能微生物培养系统配置成厌氧环境，然后将厌氧罐置于37℃下恒温培养24 h 后进行计数。

1.5 单因素试验 分别以不同龙眼多糖浸提液添加量、接种量、发酵时间、初始pH 为单因素条件，采用连续评估的方法，即对前一个发酵参数进行评估，再将其合并在随后的试验中进行后一个参数的评估，采用稀释涂布平板计数法测定各组丁酸梭菌活菌量，并比较同一因素中不同水平组活菌量差异。

1.5.1 不同龙眼多糖浸提液添加量的设置 在初始条件接种量3%、初始pH 为7.0、发酵时间14 h 条件下，设置不同龙眼多糖添加量（5%、10%、20%、30%、40%）进行发酵。

1.5.2 不同接种量的设置 采用1.5.1 中测定的最佳龙眼多糖浸提液添加量、初始pH 为7.0、发酵时间14 h，设置不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%）进行发酵。

1.5.3 不同发酵时间的设置 采用1.5.1 中测定的最佳龙眼多糖浸提液添加量、1.5.2 中的最佳接种量、初始pH为7.0，设置不同发酵时间（10、12、14、16、18 h）进行发酵。

1.5.4 不同初始pH 的设置 在最佳龙眼多糖浸提液添加量、最佳接种量、最佳发酵时间条件下，设置不同初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）进行发酵。

1.6 正交试验 本研究选取龙眼多糖添加量（A）、接种量（B）、发酵时间（C）和初始pH（D）4 个因素，每个因素设定3 个水平，以丁酸梭菌的活菌量为指标，选择正交表L9（34）进行正交试验，并通过极差和方差分析确定丁酸梭菌与龙眼多糖的最佳发酵工艺参数。正交试验表如表1 所示。

表1 正交试验因素、水平

1.7 工艺验证试验 按照优化的最佳发酵工艺，接种丁酸梭菌到500 mL 含龙眼多糖发酵培养基中，加入适量液体石蜡液封，连续发酵3 次，发酵结束后测定发酵液中的丁酸梭菌活菌量，检验优化后的发酵工艺是否稳定。

1.8 发酵前后多糖含量变化 精确吸取1.7 中发酵液样品0.5 mL 加入2 mL 无水乙醇，放入4℃冰箱中静置2 h。8 000 r/min 离心15 min，去上清，加入10 mL 蒸馏水后于80℃溶解沉淀。吸取2 mL 沉淀溶解液用1.3 中苯酚硫酸法测定多糖含量。测定发酵前后多糖含量均连测3 次。

1.9 统计分析 试验数据采用SPSS 23 进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，GraphPad Prism 6 作图。显著性检验为单因素方差分析检验，与最优组比较显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 龙眼多糖含量测定方法的线性关系 以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标、以每个浓度相对应的吸光度（A）为纵坐标，进行线性拟合后得到线性回归方程为y=0.0126x+0.0007，R2=0.999 6。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同龙眼多糖添加量对丁酸梭菌生长的影响 在温度37℃，接种量3%，初始pH 为7.0 条件下发酵14 h 后，随着龙眼多糖添加量的增多，丁酸梭菌的活菌量也越来越多（图2）。当龙眼多糖添加量为30%时，丁酸梭菌的活菌量最多，达到1.16×109CFU/mL，极显著高于其他各组，表明在龙眼多糖添加量为30% 时丁酸梭菌生长的效果最好。因此，在后续的试验中，将龙眼多糖添加量暂定为30%。

2.2.2 不同接种量对丁酸梭菌生长的影响 在温度37℃，龙眼多糖添加量为30%，初始pH 7.0 条件下发酵14 h 后，当接种量为2%时，丁酸梭菌的活菌量最高，达到5.03×108CFU/mL，极显著高于其他组（图3），表明在接种量为2%时丁酸梭菌生长的效果最好。因此，在后续试验中，将接种量暂定为2%。

2.2.3 不同发酵时间对丁酸梭菌生长的影响 在温度37℃，龙眼多糖添加量为30%，接种量2%，pH 为7.0条件下，当发酵时间为14 h 时，丁酸梭菌的活菌量达到最大值，达到2.70×108CFU/mL（图4），极显著高于其他发酵时间，表明在发酵时间为14 h 时丁酸梭菌生长的效果最好。而当发酵时间超过14 h 后丁酸梭菌的活菌量开始大幅减少，表明此时丁酸梭菌的死亡速度已经远远超过了生长速度。因此，在后续试验中，将发酵时间暂定为14 h。

2.2.4 不同初始pH 对丁酸梭菌生长的影响 在温度37℃，龙眼多糖添加量为30%，接种量2%，发酵时间14 h 条件下，如图5 所示，当初始pH 为6.0 时，丁酸梭菌的活菌量最高，达到1.11×108CFU/mL；初始pH为7.0 时，丁酸梭菌的活菌量为9.80×107CFU/mL，两者相比无显著性差异，而其他组丁酸梭菌活菌量与初始pH 为6.0 时相比差异极显著。因此，最佳初始pH 条件为6.0。

2.3 发酵工艺正交试验结果 按龙眼多糖添加量（A）、接种量（B）、发酵时间（C）和初始pH（D）4 个因素，每个因素设定3 个水平，以发酵后活菌量为考量指标，正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

从表2 中均值和极差结果可知，各单因素对于发酵结果影响的主次顺序为C（发酵时间）＞D（初始pH）＞B（接种量）＞A（龙眼多糖添加量），各因素的最佳搭配为C3D3A1B3。而方差分析结果显示各单因素对丁酸梭菌活菌量的影响差异极显著。因此，丁酸梭菌发酵龙眼多糖的最佳发酵工艺参数为龙眼多糖含量为20%、接种量为3%、发酵时间为16 h、初始pH 为7.0。

2.4 最优发酵工艺的验证试验结果 利用优化的最佳发酵工艺，即在龙眼多糖添加量20%、接种量15 mL、发酵时间16 h、初始pH 为7.0 条件下，将丁酸梭菌与龙眼多糖连续发酵3 次，通过稀释涂布平板计数法测定发酵后丁酸梭菌的活菌量。如表3 所示，发酵后丁酸梭菌的活菌量能保持在13×106CFU/mL 以上，均值为15.3×106CFU/mL，验证了该工艺的稳定性。此外，与对照组相比，发酵后丁酸梭菌的活菌量增长了2.8 倍（P＜0.01）。

表3 活菌计数结果

2.5 发酵前后多糖含量变化结果 经测定发酵前后发酵液的OD 值并换算，发酵前多糖含量均值为1 439.21 mg/mL，发酵后为1 903.86 mg/mL（表4），发酵后比发酵前多糖含量提高了464.65 mg/mL（P＜0.01）。

表4 多糖含量测量结果 mg/L

3 讨 论

本研究从龙眼多糖添加量、接种量、发酵时间和初始pH 4 个因素对丁酸梭菌发酵工艺进行探索，发现各因素在不同水平下对活菌量影响较大。邱权等[12]报道，液体发酵是生产丁酸梭菌工艺的关键一步，发酵培养基的性质以及发酵条件（温度、pH 及接种量等）都会直接影响到丁酸梭菌液体发酵的水平。作为异养微生物，丁酸梭菌需要在提供有机碳源的条件下生长，常用的有机碳源有葡萄糖等。本研究在常规培养基基础上加入龙眼多糖，结果显示活菌数显著升高，且随着龙眼多糖添加量的增加而增加，说明多糖物质得到了较好利用，龙眼多糖作为一种有机碳源能够很好地满足丁酸梭菌的快速生长。丁酸梭菌具有很强的环境适应能力，在范围较大的发酵温度和pH 条件下，较大的初始接种量都有较高的发酵水平。本研究单因素试验显示，在接种量2%时发酵效果最佳，继续增加菌体浓度反而下降，可能是接种量过高，菌体生长旺盛，导致营养物质消耗过快；另一个原因就是接种时可能把种子液中的代谢物（如丁酸、乙酸）一并接入发酵液当中，这些酸类物质都会对菌体有一定的抑制作用。丁酸梭菌在中性或偏碱的环境中发酵更好[12]。但本研究结果显示，pH 6.0 和7.0 时发酵效果最佳，可能与不同菌株的特性不同有关。发酵时间也是对发酵影响较大的因素。时间太短，发酵不完全；时间太长，细菌老化的速度相对远超生长速度。

龚小洁等[13]报道，鲜龙眼果肉接种干酪乳杆菌发酵后干酪乳杆菌活菌数增加至109CFU/mL 以上，同时胞外多糖含量明显增多，含量高达1.5 g/100g。本研究结果表明，添加龙眼多糖能促进丁酸梭菌的生长，除了活菌数量检测结果之外，在试验过程中还发现丁酸梭菌发酵龙眼多糖后产生的刺激性气味性比对照组更强，分析可能是丁酸等有效成分增加所致，这也间接证明了丁酸梭菌活菌量在添加龙眼多糖后增加。同时，本研究丁酸梭菌发酵龙眼多糖后发酵液中的多糖含量也出现增加。微生物的生长代谢具有强大分解转化物质的能力，并能产生多种次生代谢产物，与一般的物理或化学手段相比能更大幅度地改变药性，产生新的化学成分或活性更强的先导化合物[14]。多糖含量的增加可能是因为丁酸梭菌在发酵龙眼多糖过程中通过生物转化合成了更多的多糖。

4 结 论

本研究结果表明，丁酸梭菌发酵龙眼多糖的最佳发酵工艺参数为龙眼多糖含量为20%、接种量为3%、发酵时间为16 h、初始pH 为7.0，4 个因素对发酵过程的影响顺序为发酵时间＞初始pH＞龙眼多糖添加量＞接种量；验证试验证实了该发酵工艺具有一定的稳定性，发酵后丁酸梭菌的活菌量能保持在13×106CFU/mL 以上，比不添加龙眼多糖的活菌量极显著增长了2.8 倍；发酵后多糖含量比发酵前极显著提高了464.65 mg/mL。因此，本研究所筛选的发酵工艺为进一步提高含丁酸梭菌益生菌制剂的产品性能提供了新的思路。