氧化应激与非小细胞肺癌关系的研究进展

王硕

天津医科大学第二医院胸外科300211

0 引言

肺癌是恶性程度极高的癌症，根据2015年中国癌症统计数据显示，在我国肺癌的发病率和病死率均居首位[1]。按组织学类型，肺癌可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）及非小细胞肺癌（n on-small cell lung cancer，NSCLC），其中 NSCLC 占全部肺癌的80%以上[2]。NSCLC确诊时，患者常处于中晚期，5年生存率偏低。虽然，以手术治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗为主的传统治疗，以及其和近年来新兴的免疫治疗的综合运用延长了部分NSCLC患者的生存期，但仍有部分患者的治疗及预后不佳[3]。

肺是气体交换的核心器官，众多肺泡所拓展出的大面积气体交换平台与肺脏丰富的血运使肺成为氧化应激的关键场所[4]。氧化应激是指外界及机体内产生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和体内的抗氧化系统失衡，体内抗氧化系统无法清除从外界带来的或由机体内生成的活性氧，从而造成的一系列组织损伤[5]。目前，可吸入颗粒物（PM2.5）及石棉纤维已经成为现代工业社会环境中普遍的污染源，外界的ROS和体内炎性细胞、巨噬细胞、表皮细胞为清除污染物所释放的ROS使抗氧化体系不堪重负。有研究者分析了PM2.5产生的ROS对大鼠肺泡巨噬细胞的影响，结果显示肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α） 这一促炎因子及核因子E2相关因子2（n uclear factor E2-related factor，Nrf2），NF-κB 和 MAPK 等信号通路被激活[6]。同时，有研究结果表明，PM2.5能诱导NSCLC细胞上皮-间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并形成肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC），有利于NSCLC的局部侵袭及远处转移[7]。此外，一项针对Wistar大鼠的研究结果表明，肺泡中的巨噬细胞暴露于石棉纤维下，会产生大量的带电H2O2离子，激活肺内氧化应激反应，2个月的石棉接触，能使Wistar大鼠肺内产生肿块，且肿块大小与接触剂量呈正相关[8]。

氧化应激与NSCLC之间具有互相促进和依存的关系。一方面，氧化应激的存在大大提升了基因损伤概率，而肺泡细胞线粒体DNA损伤，会造成能量供应障碍，促进了肿瘤血管的生成，抑制了肿瘤免疫微环境。上述多个影响逐层累加，促进NSCLC发生。同时，氧化应激所造成的转录因子及下游细胞信号通路异常，使NSCLC发展迅速并变得易于转移[9]。另一方面，NSCLC细胞通过调节抗氧化水平和ROS水平，从而维持氧化应激反应发生在其增殖和生存适宜的水平[10]。

1 氧化应激是NSCLC发生发展的重要因素

1.1 氧化应激损伤线粒体DNA

ROS对线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的损伤作用主要体现在两方面。一是ROS诱导线粒体功能障碍，其中ROS水平升高时，会使电子传递链（electron transport chain，ETC）复合体产生缺陷，导致线粒体膜电位异常并使线粒体膜通透性增加[11]；二是mtDNA相关的免疫应答，即已经损伤的mtDNA片段从线粒体中释放，免疫原性分子可募集各种免疫细胞（如巨噬细胞、TLR9阳性T细胞和嗜中性粒细胞）到受损区域，引发炎症和免疫反应[12]。

线粒体在正常细胞增殖中扮演重要角色，氧化应激过程对线粒体的干扰会导致细胞周期停滞[13]。氧化应激参与了NSCLC中，包括起始期、促进期和进展期等的所有过程。在起始期，ROS导致mtDNA损伤，主要机制是基因序列突变和/或DNA结构改变。在促进期，ROS可促进基因表达异常，细胞间正常的信号通信被破坏，第二信使被改变，从而促进肿瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡[14]。在进展期，氧化应激可进一步改变受影响的mtDNA[15]。有研究调查了41名肺癌、膀胱癌和头颈部肿瘤患者，结果显示mtDNA突变频率比核基因突变高19～220倍，其中超过40%的肺癌患者存在mtDNA突变[16]。这一结果表明，氧化应激导致的mtDNA损伤和突变在肺癌发生发展过程中有重要作用，其可能成为肺癌防治的新靶点。

1.2 氧化应激促进新生血管形成

在NSCLC发展及癌细胞扩散过程中，新生血管形成起到了重要作用。越来越多的证据表明，ROS作为信号分子介导了肿瘤新生血管的形成[17]。已证实，众多酶系能产生ROS，其中包括环氧化酶（cyclooxygenase，COX），一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ni cotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP H），氧化酶的非吞噬细胞氧化酶（n onphagocytic cell oxidase，NO X）家族等[18]。血管内皮细胞内，ROS由NOX家族生成，根据所生成ROS的类型，NOX家族成员可进一步被划分为产生超氧化物的NOX1/2/3/5和产生H2O2的NOX4、DUOX1/2。研究结果表明，NOX介导的H2O2生成过多，可使血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体 2（VEGFR-2）被诱导表达，从而激活基质金属蛋白酶（mat rix metalloproteinase，MM P），氧化应激使NOX产生了过量H2O2，促进了肿瘤新生血管生成并使肿瘤易于扩散[19]。

此外，其他一些和血管生成相关的转录因子和基因也被ROS调控。例如，低氧诱导因子1（hypox ia inducible factor-1，HIF-1），氧化还原因子 1（redox factor 1，REF-1），核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和激活蛋白 1（activa tor protein-1，AP-1）被认为是对氧化还原敏感的转录因子[20]。ROS诱导的HIF表达也表明，在内皮细胞内氧化应激对NOX表达起到了正反馈调节作用[21]。

1.3 氧化应激使细胞信号通路异常

表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）属于人表皮生长因子受体（human EGFR，HER）跨膜受体Tyr激酶家族。EGFR的扩增、突变或蛋白过表达所形成的异常，会导致EGFR介导的信号通路失调，进而导致肿瘤的发生，特别是肺癌的发生与EGFR密切相关。目前，EGFRTyr激酶抑制剂(TKIs)已被用于EGFR突变的NSCLC患者的治疗[22]。

EGFR与氧化应激之间存在关联。H2O2会使人肺癌细胞中EGFR磷酸化表达升高[23]。同EGF诱导的EGFR激活不同，H2O2会优先诱导EGFR酪氨酸磷酸化，而EGF会同时触发丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）和Tyr受体磷酸化，H2O2抑制Cys依赖的酪氨酸蛋白磷酸酯酶（prote in tyrosine phosphatases，PT Ps）可能是诱导EGFR Tyr磷酸化的重要机制。EGFR的细胞内激酶结构域包含6个半胱氨酸残基，其中Cys797位于三磷酸腺苷结合囊内，会优先成为内源性H2O2的靶点。Cys797被氧化后，EGFR激酶活性增加，因此PTPs和/或EGFR中特定残基的氧化增强了下游信号[24]。

除了增加EGFR Tyr的磷酸化外，H2O2还可作为调节信号转导的第二信使[25]。EGF被刺激后，EGFR将激活信号传递给下游信号通路，包括Ras/MAPK和PI3K/Akt通路。H2O2可调节SRC同源区2结构域蛋白C（SRC homology domain 2 containing protein，SHC）、生长因子受体结合蛋白 2（growth factor receptor bound protein 2，Grb2） 和鸟嘌呤核苷酸交换蛋白（so n of sevenless homologue，S OS），形成SHC-Grb2-SOS复合体，而SHC-Grb2-SOS复合体与EGFR结合后会促进三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）与大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）蛋白的二磷酸鸟苷（Guanosine diphosphate，GDP）交换，这一途径对癌症的发生和发展起到了促进作用，包括生长、增殖、分化、迁移和抑制凋亡[26]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化和NSCLC密切相关[27]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表达与肺癌相关的许多基因突变有关，包括EGFR和鼠类肉瘤病毒癌（Kirsten rat sarcoma，KRAS）基因的激活。EGFR 在肺癌细胞中表达突变时，PI3K及Akt通过转录、信号转导和激活因子被激活。因此，许多NSCLC组织中检测出了PI3K下游介质，而超过50%的NSCLC组织中，Akt磷酸化水平升高，其与肺癌进展相关[28]。

2 NSCLC调控ROS浓度及高水平ROS的治疗作用

2.1 NSCLC通过激活抗氧化通路控制ROS水平

在NSCLC的发展阶段，过量的ROS蓄积会启动细胞凋亡及自噬进程，而抗氧化通路的过度激活能使 NSCLC逃脱过量的 ROS损伤[29]。NF-κB及Nrf2等原本具有机体保护作用的抑制因子被过度激活，从而使NSCLC逃逸了ROS蓄积所造成的氧化损伤。NF-κB作为转录因子，在细胞增殖、存活、调节细胞周期和药物治疗耐药性的形成中发挥重要作用，其是一种已知的氧化应激传感器，可检测低水平的H2O2[30]。Nrf2是抗氧化途径重要的调控因子，其在肿瘤细胞中被激活，从而增加抗氧化蛋白的产生并维持氧化还原平衡。细胞核中，Nrf2与碱性亮氨酸拉链伴侣（b asicleucinezipper，bZi p）二聚，并与位于Ⅱ期启动子和抗氧化基因中的抗氧化反应元件（anti oxidant reaction eleme nt，ARE）结合，Nrf2 与ARE结合后会使包括谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（superoxide dismutas e，SOD）及热休克蛋白在内的多种抗氧化酶的水平升高[31]。Nrf2/ARE通路的损伤可导致氧化应激、炎症和线粒体功能障碍，Nrf2可被香烟烟雾、感染、氧化应激或炎症激活，Nrf2通路的过度激活创造了有利于NSCLC细胞生存的环境，保护其免受氧化应激的影响[32]。

2.2 高浓度ROS在NSCLC治疗中的作用

长期低水平的ROS暴露可促进NSCLC的细胞有丝分裂、细胞存活、细胞生长、细胞增殖和血管生成[33]。肿瘤起始细胞（tu mor initiatingcells，TICs）在肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）药物和化疗药物的耐药方面起着重要作用，药物外排泵系统在TICs中的过表达是TICs耐药的重要机制。研究结果表明，低浓度的ROS可诱导药物外排泵 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的上调，从而使细胞获得多重耐药（multiple drug resistance，MDR）表型；低浓度（1 μmol/L）的 H2O2处理，可使P-gp过度表达，而高浓度（10μmol/L）的 H2O2处理则会抑制细胞表达P-gp。因此，ROS浓度和P-gp介导的肿瘤耐药性相关[34]。

在癌细胞中，细胞内ROS的适度升高可促进其生长和增殖；另一方面，高水平的ROS又可诱导细胞凋亡[35]。癌细胞比非癌症转化细胞对升高的细胞内ROS更敏感，因此利用ROS诱导小分子靶向肿瘤治疗已被认为是一种潜在的治疗策略[36]。荜茇酰胺（Piperlongumine，PL）是从胡椒植物中分离得到的天然生物碱。PL被认为是一种有效的潜在抗癌药物，其通过抑制细胞中负责抑制ROS和氧化应激的机制来提高ROS水平，从而选择性地杀死癌细胞。在细胞中负责调节氧化应激的蛋白，如谷胱甘肽S-转移酶 P1（glu tathione S-transferase P1，GST P1）和羰基还原酶 1（Carbonyl reductases，CBR1）均为 PL 的结合靶标。在体内和体外模型实验中，都证实PL具有诱导选择性肿瘤细胞毒性的特征[37]。

3 结 语

氧化应激与抗氧化系统间的平衡无疑对于癌症防治具有重要意义。如前文所述，氧化应激是NSCLC发生的重要因素，氧化应激造成线粒体功能障碍，从而损伤基因组稳定性，并通过激活EGFR及mTOR等细胞信号通路促进NSCLC组织中新生血管的形成，进一步促进肿瘤局部侵袭及远端转移。高浓度的ROS又体现出了促进NSCLC凋亡及自噬的作用。通过高浓度ROS清除肿瘤细胞是经典的顺铂等化疗药物的主要作用机制之一[38]。癌症进展到晚期时，ROS蓄积会激活NF-κB及Nrf2等抗氧化转录因子及下游信号通路，通过对抗氧化通路的过度激活，肿瘤细胞就获得了对化疗药物的抗药性，从而肿瘤微环境中的ROS被维持在促进肿瘤细胞侵袭和转移的适宜浓度。

PL这类可促进产生ROS的化合物在临床有广阔的应用前景，其不单可产生肿瘤细胞毒性，可同时作为佐剂联合其他抗肿瘤治疗药物，提高癌细胞对治疗的敏感性。例如，应用光动力治疗与能产生ROS的化疗药物相结合，能显著提高治疗效果且降低了脱靶效应[39]。前期的研究成果，引起研究者重点关注基于ROS的综合治疗，并使其成为目前的研究热点。虽然，目前临床上已应用诸多治疗癌症的方案，然而降低肿瘤对具有特定作用机制的药物的耐药性，需要不同于传统治疗的新策略。通过抑制内源性抗氧化作用来升高细胞内ROS，调节负责维持氧化还原稳态的蛋白质的功能，在肿瘤治疗领域已初步展现出良好的疗效[40]。联合策略是调节耐药的另一途径，ROS诱导剂和商业药物的联合，在选择性杀伤肿瘤方面显示了很大的前景。

在肿瘤细胞/耐药肿瘤细胞微环境中，升高ROS水平可增强氧化应激反应，增强肿瘤对化疗药物的易损性。降低细胞内ROS是诱导肿瘤耐药的介导因素，因此肿瘤耐药这是一个浓度依赖性现象。需要解决的问题之一就是如何界定ROS水平的低值和高值，从而评估其浓度依赖效应对耐药性的影响，从而将其作为一种治疗手段。未来，设计利用有机小分子化合物调控控制细胞内ROS水平，将有望成为潜在的NSCLC治疗方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突