CD4＋CXCR5＋T细胞及程序坏死因子在结核中的作用机制

孙海柏 冯冉冉 张东 王潇 刘佳庆

天津市海河医院检验科300350

0 引 言

结核病（tuberculosis）是因人体感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）而引起的慢性传染性疾病，是严重危害人类生命和健康的重要传染病之一[2]。世界卫生组织的数据显示，中国每年死于结核病的人数多达十三万[1]。由于实验室检验结核病的低特异性，以及临床治疗时的随访指标匮乏，使研究者关注结核病致病的免疫学机制。结核分枝杆菌是一类胞内寄生性细菌，其引起的主要免疫应答为细胞免疫[3]。结核分枝杆菌能够诱导辅助性Th1细胞、Th2细胞移动并发挥作用，导致机体的免疫功能紊乱，进而引发程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配体（PD-L1）在结核病患者中高表达[4]，尤其是降低肺结核病患者的CD4+T细胞免疫功能[5]。

CD4+T细胞可以产生免疫调节剂，如白细胞介素 12（interleukin-12，IL-12）、干扰素 γ（interferon gamma，IFN-γ）和淋巴毒素 α，CD8+T 细胞和 γδT 细胞通过释放穿孔素和颗粒酶，在Fas配体的依赖和非依赖机制下对结核菌和被感染的细胞产生直接效应。外周T细胞通过识别结核杆菌早期分泌蛋白和Mtb39等结核菌抗原，刺激IFN-γ和肿瘤坏死因子α的产生[6]。滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）是新型的CD4+T细胞的独立亚群，可以表达C-X-C趋化因子受体5（C-X-C chemokine receptor type 5，CXCR5）、诱导性协同刺激因子（inducible costimulator，ICOS）、PD-1、B 细胞淋巴瘤（B-cell lymphoma 6，BCL-6）原癌基基因、IL-21 等细胞因子。Tfh细胞的主要功能是辅助B细胞产生抗体和辅助抗体类别转换，促使高亲和力B细胞分化为浆细胞或记忆细胞，从而促进体液免疫应答的过程[7]。Tfh细胞与多种自身免疫性疾病、免疫缺陷病和感染性疾病的发生发展有密切关系，其中CXCR5是Tfh细胞的特异性标志物，是Tfh迁移和定位的重要“转运分子”，可募集Tfh与B细胞汇合并相互作用；ICOS与其受体ICOSL结合并相互作用，促进Tfh细胞的产生和生发中心的形成；PD-1是Tfh细胞高表达的抑制性因子受体，作为Tfh细胞的表面标志物之一提供抑制信号，抑制Tfh细胞增殖，防Tfh细胞的过度转化，且协助B细胞向浆细胞转换，在调节因微生物引起的感染性免疫中发挥重要作用。本研究中，将Tfh细胞和PD-1作为主要研究对象，分别观察其在肺结核病不同阶段的表达规律和变化趋势，探讨Tfh细胞、PD-1在肺结核中诊断和治疗中的作用。本研究可以揭示Tfh细胞在肺结核病中的免疫学作用和临床意义，同时为探索肺结核疾病的诊断和疗效评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择天津市海河医院2018年1月至2019年1月收治的肺结核病确诊患者140例，其中男性85例，女性55例，年龄（42.2±18.2）岁。另外选择在天津市海河医院体检中心进行胸片检查的健康者140例，其中男 78例，女 62例，年龄（38.1±17.2）岁。肺结核病诊断标准为：根据《结核病诊断和治疗指南》的标准，满足以下任何一条，即可确诊。痰查抗酸杆菌阳性2次；痰查抗酸杆菌阳性1次，同时结核分枝杆菌培养阳性1次；痰查抗酸杆菌阳性1次，同时胸部X线摄片显示肺结核征象。

入组标准：未经抗结核治疗或治疗时间不满1周者；严格遵守6个月短程治疗方案2HREZ/4HR或2HREZ/4（HR）3，必要时改为9个月强化治疗方案3HREZ/6HRE，且期间不得增加或改用其他抗结核药者；无恶性肿瘤、糖尿病、尘肺、肝炎、严重心肝肾疾病、艾滋病等合并症者；胸部影像学检查无异常者；女性为非孕期、非哺乳期；自愿签署知情同意书者。

排除标准：经过抗结核治疗超过1周者；治疗期间增加或改用其他抗结核药者；既往有尘肺、艾滋病、结核病、糖尿病、肝炎、严重心肝肾疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤等病史者；使用免疫抑制剂和免疫增强剂的系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、类风湿病、风湿病、多发性硬化症等免疫系统疾病患者；孕期、哺乳期女性患者；未签署知情同意书或中途退出研究者。

1.2 方法

1.2.1 主要材料与仪器

BB515（CD4）、AF647（CXCR5）、PerCP-Cy5．5（PD-1）荧光染色剂（美国BD公司）。BDFACSCanto II型流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2.2 分组方法

140例肺结核患者均入肺结核组，140例健康者均入健康对照组；肺结核组与对照组性别、年龄的差异无统计学意义。所有肺结核组患者的治疗方案均为世界卫生组织推荐的6个月的利福平用药2HREZ/4HR 或 2HREZ/4（HR）3短程治疗方案；治疗2个月末痰涂片结果未转阴者，改为9个月的利福平用药3HREZ/6HRE强化治疗方案。根据经过治疗后转归情况，将肺结核组的140例患者，进一步分为痰涂片转阴组（PTB-SN）120例；痰涂片未转阴组（PTB-SP）20例。

1.2.3 标本采集

健康对照组和肺结核组中的所有受试者均于清晨空腹采集外周血4 ml，所有样本均在采集后2 h内进行处理和分析。外周血单个核细胞分离方法为：取乙二胺四乙酸（ethy lenediaminetetraacetate acid,EDT A）抗凝的新鲜外周静脉血，离心，除去上层血浆；加入与除去的血浆等体积的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），混合均匀；取离心管，向管内加入5 ml淋巴细胞分离液；用吸管吸取上述稀释后的血液，沿离心管侧壁小心缓慢地加到淋巴细胞分离液之上，使二者形成明显的界面；离心后，可见离心管中的液体分为四层，由上至下依次为血浆和血小板层，单个核细胞层（呈白色雾状）、淋巴细胞分离液层，多形核白细胞和红细胞层；准备新的离心管，用移液器轻轻插入单个核细胞层，小心吸取液体后加入新管中；加入2 ml PBS充分混匀后离心，弃上清；再加入2 ml PBS洗液重悬细胞并混匀，离心弃上清，并重复一遍此步骤；洗涤3遍后，悬于1 ml含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，充分混匀。从而制成用于流式细胞术检测的单个核细胞悬液。

1.2.4 Tfh细胞和PD-1含量的测定

取3支流式上样管，分别标记编号（1～3），在各流式管中加入100μl单个核细胞悬液；按照试剂说明书，向管1和管2中依次加入BB515（CD4）、AF647（CXCR5）、PerCP-Cy5.5（PD-1）荧光抗体，管 3 中不加任何抗体（空白对照）；各管内液体混匀后避光孵育30 min；取出各管，离心去上清，重复洗2次后加PBS重悬；使用流式细胞仪检测Tfh细胞和PD-1；用Diva软件进行细胞组分分析，计算Tfh细胞、PD-1因子，以及其他相关细胞的含量或比例。比较肺结核组与健康对照组研究对象的Tfh细胞、PD-1的差异；比较痰涂片转阴组和未转阴组在治疗周期中的差异。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件处理数据。符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示；方差齐性检验后，采用t检验比较各组间的差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tfh 细胞和CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞测定

肺结核组和健康对照组外周血单个核细胞中Tfh 细胞（CD4＋CXCR5＋T 细胞）、CD4＋CXCR5＋ICOS＋T细胞、CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞的检测结果及分析策略图，如图1所示。图1中，前向散射光（forward scatter，FSC）反映细胞的大小；侧向散射光（side scatter，SSC）反映细胞的复杂程度；A表示面积。

2.2 短程治疗前后肺结核组与健康对照组Tfh细胞比较

利福平短程治疗前、后，肺结核组与健康对照组的Tfh细胞比例比较，如图2所示。治疗前，肺结核组外周血单个核细胞中Tfh细胞/CD4＋T细胞比例为3.37%±0.45%，显著高于健康对照组的2.22%±0.47%，差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗后，肺结核组外周血单个核细胞中Tfh细胞/CD4＋T细胞比例为2.39%±0.38%，与治疗前（3.37%±0.45%）相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；且与健康对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 短程治疗前后肺结核组与健康对照组PD-1比较

利福平短程治疗前、后，肺结核组与健康对照组的PD-1比较，如图3所示。治疗前，肺结核组患者 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞/Tfh 细胞比例为25.33%±10.08%，显著高于健康对照组的8.42%±2.31%，差异有统计学意义（P＜0.01）。治疗后，肺结核组患者的 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞/Tfh 细胞比例为11.35%±2.65%，显著低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.01）；且与健康对照组相比，差异无统计学差异（P＞0.05）。

2.4 治疗周期对Tfh细胞和PD-1的影响

对于肺结核组中的痰涂片转阴和痰涂片未转阴的2个亚组，其在治疗周期中的Tfh细胞和PD-1变化分别如图4和图5所示。

如图4所示，对于痰涂片转阴组，与治疗前相比，治疗5个月和6个月后，其外周血中Tfh细胞比例明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05和P＜0.01）。对于痰涂片未转阴组，与治疗前相比，治疗6个月后，其外周血中Tfh细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在治疗5个月和6个月后，痰涂片转阴组的Tfh细胞比例明显低于痰涂片未转阴组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

结果表明，痰涂片转阴组和痰涂片未转阴组的外周血PD-1在治疗过程中均呈缓慢下降趋势。与治疗前相比，痰涂片转阴组在治疗5个月和6个月后，以及痰涂片未转阴组在治疗后2个月、5个月和6 个月后，CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞/Tfh 细胞比例均有明显降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。在治疗2个月、5个月和6个月后，与痰涂片未转阴组相比，痰涂片转阴组的CD4＋CXCR5＋PD-1＋T细胞/Tfh细胞比例明显降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 Tfh细胞流式细胞检测及分析策略图

图2 肺结核组在利福平短程治疗前、后与健康对照组Tfh细胞的比较

图3 肺结核组在利福平短程治疗前、后与健康对照组PD-1的比较

图4 痰涂片转阴组和痰涂片未转阴组在治疗周期中的Tfh细胞变化趋势

3 讨论与结论

有研究结果表明，Tfh细胞与某些疾病的发生相关[8-10]，Tfh细胞参与某些自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮[11]、免疫缺陷病[12]、感染性疾病[13]、肿瘤[14]和移植排斥等。本研究结果表明，在肺结核病的发生过程中，有Tfh细胞的参与。肺结核病是由结核分枝杆菌感染人体引起的，感染过程中占主要地位的是细胞免疫反应，且以淋巴细胞介导为主。目前，肺结核诊断的最新标准包括：病理检查、涂片查抗酸杆菌、痰培养、结核分枝杆菌荧光染色镜检等。其中，荧光染色镜检敏感性很好，但很多医院没有开展[15]。因此，本研究仍然采用传统的诊断标准选取病例样本。

本研究结果表明，与健康对照组和肺结核组治疗后相比，肺结核组在治疗前有更高的Tfh细胞比例，提示Tfh细胞可能与结核周期变化相关。在治疗过程中，随着痰涂片转阴，Tfh细胞呈下降趋势，且在治疗后，外周血中的Tfh细胞比例恢复到和健康对照组相当的水平，提示Tfh细胞的变化趋势可以反映肺结核病的治疗效果，对结核病的诊断和疗效评估有一定的指导意义。

PD-1通过PD-1/PD-L通路控制宿主的免疫防御[17]，其对患者体内的T细胞凋亡的调节作用是导致结核杆菌持续存在的原因之一，提示PD-1同样参与了肺结核病的发生过程[16]。本文的研究结果表明，肺结核组患者在治疗后，其PD-1比例均明显降低，提示PD-1在肺结核病中同样发挥重要的作用，而且与体内Tfh细胞在结核周期中的反应呈正相关关系。在治疗过程中，痰涂片转阴组和痰涂片未转阴组的PD-1均呈下降趋势，且在不同的治疗周期两组间存在明显差异。该结果提示，PD-1比例与肺结核患者体内结核分枝杆菌的含量和患者体内能否清除结核分枝杆菌有一定的关系[18]。本文结果为使用PD-1抑制剂进行结核病治疗提供了理论依据，推测使用抗结核药物联合PD-1抑制剂将有助于结核病的治疗。

图5 痰涂片转阴组和痰涂片未转阴组在治疗周期中的PD-1变化趋势

本研究结果表明，肺结核组患者外周血单个核细胞中 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞/Tfh细胞比例显著高于健康对照组受试者，提示PD-1参与了肺结核病的发生和发展。该结果与Bandaru等[19]和Jurado等[20]的研究结果一致。结核分枝杆菌感染时，体内T淋巴细胞上的PD-1表达升高，且对于不同阶段的肺结核病，其PD-1表达量有差异。此外，痰涂片转阴组的 CD4＋CXCR5＋PD-1＋T 细胞比例在治疗周期中呈下降趋势。前期研究结果表明，肺结核患者外周血中PD-1表达升高，且PD-1的表达升高与肺结核患者细胞免疫功能下降相关[4]。研究结果证实，许多病原感染，包括病毒、细菌和原虫等，其利用PD-1/PD-L通路削弱宿主的免疫防御能力，促使感染的病原持续存在[21]。而阻断PD-1/PD-L通路可以显著提高T淋巴细胞的抗结核能力，说明PD-1/PD-L通路与结核持续慢性感染息息相关。因此，PD-1在肺结核病的发生和发展中发挥着重要的作用。

综上所述，本研究结果表明，Tfh细胞及其释放的细胞因子PD-1与结核病的病情、治疗周期、治疗效果等存在一定的相关性。因此，监测肺结核患者的Tfh细胞水平、PD-1水平，有助于对肺结核进行诊断，对结核病的治疗和转归具有一定的指导意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突