水凝胶及其在神经再生中作用的研究进展

郭景玥 徐兰举 张琳 王淑芳

南开大学生命科学学院，生物活性材料教育部重点实验室，天津300071

0 引 言

人的神经系统一般分为中枢神经系统（脑和脊髓）和周围神经系统（脑神经和脊神经）两部分。目前，只有神经导管材料在周围神经修复方面取得了一定的成功，而用于解决更复杂神经系统问题的商业化产品极少。例如，对由中枢神经系统紊乱导致的神经退行性疾病、脱髓鞘疾病和缺血性损伤等疾病，目前还没有有效的治疗或修复手段。当前，上述疾病的治疗手段主要有神经保护疗法和神经再生疗法[1]。神经保护疗法主要是减轻疾病的发病症状，旨在防止进一步的组织损伤和疾病复发。神经再生疗法是试图替换损伤的神经组织或促进现有组织在神经系统内再生，但这类方法多数尚处于实验阶段，许多问题亟待解决。这些问题包括：血脑屏障的存在使许多药物无法进入神经系统[2]；成人的神经元再生能力较差，且微环境中存在大量抑制因子，如髓磷脂相关糖蛋白和硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）等[3]。

神经组织工程是利用基质、细胞和生长因子来促进神经元分化和再生的方法。水凝胶作为有利于细胞生长的聚合物材料，能提供与细胞外基质结构相似的组织发育所需的平台。通过对水凝胶系统进行不同的修饰和改进，可应对神经修复中遇到的各种挑战。本文中，对水凝胶在神经再生中的作用进行了综述，对水凝胶在神经组织工程中的重要地位进行了分析。

1 水凝胶系统的物理性质及其对神经再生的引导作用

神经元由细胞体和神经突起（轴突和树突）组成，可长距离传导动作电位。细胞突起中，轴突通过其表面的微结构来探索周围环境，从而引发诸如神经伸展或神经收缩等适应性反应[4]。尽管神经元对神经组织的功能至关重要，但在体内还有神经胶质细胞作为其辅助，起到支持作用。但是，同时将神经胶质细胞和神经祖细胞包封在水凝胶中并不容易，通常是通过模仿体内环境来设计基质支架，让神经突起能沿支架表面移行，并根据基质表面形貌改变移行方向[5-6]。在由轴突损伤造成的脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化等疾病中，已经发现水凝胶具有促进轴突修复、生长和功能恢复的作用[7-8]，其中的一部分就是通过使轴突感知基质表面微形貌而实现的[9]。总结已有的相关研究，可知水凝胶主要是从影响神经细胞膜感受到的机械压力、基质上神经元细胞骨架的动态和神经元的力学感受能力3个方面，调节轴突的生长和发育。

1.1 细胞膜感受到的机械压力

周围环境与神经元的相互作用对神经元的形态和功能具有影响。神经元在其膜与水凝胶的交界面感受到的机械压力，在很大程度上决定了轴突的生长状态和方向。基质的机械性能在神经胶质细胞和神经细胞的表型调节中起着关键作用。例如，施旺（Schwann）细胞适合在弹性模量为2～5 kPa的基质上生长[10]，此时其可极化成神经突起；神经突起适合在弹性模量为0.05～0.275 kPa的基质上生长，此时其向外生长能力会得到增强[11-14]。研究者在由海藻酸盐和钙离子制备的3D水凝胶基质上也发现了类似的结果，即神经干细胞在具有相对较低硬度（弹性模量约180 Pa）的海藻酸盐3D水凝胶基质上培养时，神经元特异蛋白（β-Ⅲ微管蛋白）的表达增加[15]。上述研究结果表明，神经干细胞的分化和水凝胶基质的机械强度之间存在相关性。类似地，在具有不同弹性模量的经甲基丙烯酸酯改性的透明质酸制备的3D水凝胶基质上，研究者培养了由人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化成的神经祖细胞，结果表明在低弹性模量组中，神经祖细胞向神经元分化的效率更高[16]。

此外，轴突倾向于沿着基质表面具有的取向结构进行生长。研究者在由聚甲基丙烯酸甲酯制成的水凝胶上培养成熟的神经元轴突，发现轴突更喜欢沿着基质表面的纳米级脊边缘黏附和伸长[17]，但是这种趋向性生长的具体机制和原因尚不明确。

1.2 基质上神经元的细胞骨架动态

神经细胞中的细胞骨架蛋白主要包括中间纤维蛋白、微管蛋白及纤维状肌动蛋白3种。肌动蛋白存在于神经突起的膜下，具有为膜提供稳定性和为短距离传输提供支持平台的作用。神经突起的外向性生长依赖于两个既相互独立又相互作用的细胞骨架系统——肌动蛋白和微管[18]。与肌动蛋白不同，微管是轴突内存在的空心管状结构，其弯曲刚度远高于肌动蛋白纤维，能抵抗压缩力。肌动蛋白和微管的交联程度可决定轴突的硬度和机械强度[19-20]。最近的一项研究结果表明，当胚胎和成人来源神经元祖细胞在具有不同力学特性的水凝胶上黏附并发生分化时，当水凝胶的弹性模量为2 kPa时，β1-整合素的表达有显著增加，说明此时对神经突起的生长更有利[21]。

Elkin等[22]发现，当神经元细胞培养在力学特性与脑组织相当（约0.17 kPa±0.03 kPa）的水凝胶表面时，其生长情况更好，有利于形成较大的周向网络，而当在更软的基质上培养时，F-肌动蛋白纤维的平均长度明显缩短[23]。由此推测，水凝胶的力学特性差异可能通过影响F-肌动蛋白等细胞骨架的排列方式，进而影响神经突起的生长。水凝胶基质与肌动蛋白的相互作用机制尚未明确，其中最有可能的机制是水凝胶基质的力学特性通过影响肌动蛋白的动态，进而调节神经细胞内募集信号蛋白，如黏着斑激酶、A-肌动蛋白[19]，而这两种信号蛋白最终会影响神经突起和水凝胶基质的黏附。通过直接调节F-肌动蛋白的调节蛋白，如YES相关蛋白（yes associated protein，YAP）和具有PZD结构域的转录共激活剂（tafazzin，TAZ），可影响 F-肌动蛋白聚合能力和神经细胞中应激纤维的形成，这种方法已经成功应用于基于水凝胶的神经细胞培养研究中[24]。

1.3 神经元的力学感知能力

神经系统的神经元膜上有离子通道参与递质释放、激素分泌、信号转导、代谢调控和细胞生长等重要生理过程的调控。此外，神经元所处环境中，物理参数的改变（如表面形貌，硬度/强度，亲水性和表面电荷等）可能会通过影响其离子通道的状态，从而引起细胞动态变化和响应。神经元拥有能被机械力激活的离子通道，所以可将感受到的力转化成生物化学信号。有研究结果表明，对聚丙烯酰胺水凝胶中培养的神经细胞施加机械应力会产生生长锥分解、神经突起收缩和细胞骨架改变等反应，这些情况主要是由于机械拉伸使离子通道激活，从而导致神经细胞和生长锥细胞内钙离子水平发生急剧变化[4]。但是，对于更大尺度的水凝胶基质，有关神经元的机械敏感性离子通道作用的相关研究较少，需要进一步研究。

2 水凝胶系统的生物分子控制释放对神经再生的促进作用

水凝胶不仅可为神经元再生提供机械支持和物理引导，还可将外源生物分子加入水凝胶基质中。水凝胶系统中，这些生物分子控制释放，可为神经再生提供更适宜的环境。一般来说，水凝胶是通过自降解来释放生物分子的，主要途径有2种，分别是聚合物网络的分解和聚合物内部键的断裂[25]。其中，如何通过调节聚合物含量、分子量、交联程度等因素，控制水凝胶的自降解速率是神经组织工程的研究重点之一。

2.1 释放神经元营养因子

神经营养因子是一类在神经组织工程中备受关注的生物分子，其能促进神经细胞存活、生长和分化。常见的神经营养因子有神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、神经营养蛋白 3（neurotrophin 3，NT3）、NT4、胶质细胞系衍生的神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）和睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）。这些蛋白均可通过结合反应性神经细胞表面受体，促进神经元发育和成熟，加强成熟神经细胞的存活能力，增加神经细胞的再生作用。例如，BDNF及其受体在神经系统广泛表达，可通过高亲和力受体酪氨酸蛋白激酶B（t yrosine kinase receptor B，Trk B）发挥作用。王莹等[26]在研究中发现，二氢睾酮可有效激活BDNF及受体Trk B的表达，减少抑制神经轴突再生的有害因素，从而使神经突起的环境得到改善，促进神经功能的恢复。Edalat等[27]选用 pDsRed1-N1-NT-3和 pCMX-Trk C质粒转染间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），发现转染后的MSCs能长时间高表达NT3和Trk C受体，使干细胞的存活率和向神经细胞分化的能力得到提高，并减少了细胞凋亡，表明Trk C受体可提高NT3的利用率并促进其修复脊髓损伤。

有研究者在中风小鼠模型中，用透明质酸水凝胶递送BDNF，发现因子经过3周时间可从中风处扩散到梗死的周围组织，能诱导成熟的神经元迁移到梗死周围皮层中，并长期存活，还能促进现有的皮质和皮质纹状体系统内的突触发芽，加快运动功能的恢复[28]。然而，通过释放营养因子促进神经再生也存在一些问题，如再生神经细胞在特定的生长阶段需要特定的因子浓度，因此水凝胶系统也需要配合这种需要。针对该问题，有研究者对常用的聚乳酸（polylatic acid，PLA）-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）水凝胶进行了一系列的化学修饰，使其可在最初突释后，缓慢持续释放NT3，以实现对神经生长的积极作用[29]。此外，这种装载了NT3的水凝胶在脊髓损伤的动物模型上也得到了成功应用，相关研究中观察到了轴突再生的改善[30]。

不仅水凝胶的物理和化学特性会对生物分子释放的持续时间和递送剂量有重要影响，某些营养因子也会与水凝胶产生相互作用，而使其生物分子释放曲线受到影响[31]。此外，在水凝胶基质中掺入包有营养因子的微米或纳米颗粒，可实现多种生物分子的顺序控制释放，从而达到最佳治疗效果[32]。

2.2 释放神经生长抑制剂的拮抗剂

神经组织修复过程中的一项重大挑战是损伤组织周围存在各种抑制性分子，导致这一区域处于抑制环境中，而影响修复效果。由星形胶质细胞和结缔组织组成的神经胶质瘢痕是轴突再生的主要障碍之一。瘢痕内的活化神经胶质细胞会产生抑制分子，如勿动蛋白（nogoprotein，Nogo）、CSPGs[33]、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）[34]、髓鞘相关糖蛋白（myelinassociatedglycoprotein，MAG）[35]等，这些蛋白极大地阻碍了神经再生过程。Nogo、OMgp和MAG都通过其共同的受体Nogo-66（NgR）结合转导抑制活性，但将NgR基因敲除仅有轻度作用，表明这些分子还有其他的受体存在。随着科技的不断发展，现已发现神经系统存在一种成对的免疫球蛋白样的受体B（p aired immunoglobulin-like receptor B，Pir B），是Nogo、MAG、OMgp的高亲和力受体。因此，当同时阻断NgR和PirB的活性时，研究者发现髓鞘相关的抑制作用几乎被完全消除[36]。硫酸软骨素酶ABC（chondritinase ABC，Ch ABC）是由普通变形杆菌产生的一种酶类，可催化分解黏多糖类。有研究结果表明，Ch ABC不仅可通过降低损伤脊髓局部的CAPGs促进损伤的轴突修复和再生，还能加速脊髓损伤后功能障碍的恢复[37]。

2.3 释放药物分子

甲强龙（methylprednisolone，MP）是一种抗炎糖皮质激素，具有抗氧化作用，其已在脊髓损伤的临床治疗中得到了应用，但损伤修复所需的MP巨大用量会导致严重的副反应，在临床应用中一直有争议[38-39]。因此，如何对药物进行高效靶向传输，延长药物循环的半衰期是相关治疗技术发展的重点。越来越多的研究结果表明，纳米载体具有靶向给药和增加药物的生物利用度的潜力[40]。不仅如此，已发现由纳米尺度的多巴胺聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）-聚 丙 烯 酸（polyacrylic acid，PAAc）制成的凝胶可穿过血脑屏障，在脑实质内释放神经递质[41]。

可注射水凝胶已被广泛应用于各种神经系统疾病中的治疗性分子递送，尤其是用于治疗神经系统中出现的肿瘤。水凝胶系统在神经胶质瘤治疗的相关中已得到广泛应用，有研究者通过一种高通量的定量测量3D技术，研究神经胶质瘤的增殖和入侵的方法，将硫醇化透明质酸和明胶组成的光学透明水凝胶与硫醇反应性聚(乙二醇)聚合物进行化学交联，以形成人造3D肿瘤微环境[42]。该3D肿瘤微环境对寻找、筛选抗癌药物的体外实验和用于安全性评估等体内实验有重要作用，尤其能弥补药物实验在动物模型上的效果差距，因为动物模型既昂贵又费时，且不能完全反映人类肿瘤的生物学特征。

2.4 水凝胶中的细胞成分

作为组织工程三要素之一，种子细胞在神经组织工程中已经得到了应用。但直接局部注射种子细胞虽能提高再生和修复效果[43]，但存在种子细胞大量流失，利用效率低等问题。而使用水凝胶系统可模仿细胞基质环境，利于细胞保持活性和增殖，提高细胞利用率。有研究者将负载有iPSCs诱导产生的神经干细胞的3DGelMA水凝胶植入脊髓损伤部位，发现其可减少炎症，促进轴突和神经元再生，并抑制神经胶质瘢痕增生[44]。另外，有研究者通过叠氮苯基光化学反应将甲基丙烯酸化肝素接枝到聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯制成的水凝胶中，通过肝素负载成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和神经干细胞，结果表明这种基质支架可使干细胞的黏附和分化能力增强，有利于小鼠脊髓损伤模型的神经元再生[45]。上述研究结果表明，联合使用负载细胞和药物分子可起到协同作用。

除了在水凝胶中掺入简单的肽外，也有研究者尝试使用某些自组装肽（self-assemblypeptide，SAP）形成水凝胶。SAP是一种小肽，可自我组装后形成纳米纤维基质，可掺入生物活性序列并适于外部刺激触发的响应，如pH值、离子梯度、疏水性、温度[46]。分子与分子间或分子内部之间存在非共价键相互协同作用力，使分子能在空间上实现重排和堆积，利用这种作用力就能通过分子自组装，产生具有所需特性的凝胶。例如，将神经干细胞植入RADA16-YIGSR自组装短肽，可自发性地组装成的纳米纤维。与单独使用神经干细胞相比，SAP水凝胶中的神经干细胞向神经元的分化能力更强，并可减少由β淀粉样蛋白诱导的凋亡细胞数，具有治疗阿尔茨海默症的发展前景[47]。上述研究结果已经显示出SAP水凝胶系统对神经再生的积极作用，但SAP水凝胶在大脑内发挥作用后，是否会影响大脑反应功能或产生行为变化等影响尚不明确。

3 电传导水凝胶在神经再生中的作用

从常规的肌肉运动到复杂的脑部能力（如记忆和推理），都是依靠中枢神经和周围神经通过复杂的神经元细胞网络不断产生并接受电和生化信号来完成的。越来越多的研究结果表明，对受损的神经组织施加电刺激，对神经再生和修复过程有影响。由单宁酸、吡咯和Fe3+混合形成的具有多孔结构的导电水凝胶可抑制星形胶质细胞发育，并加速神经干细胞向神经元的分化，将其植入体内后，发现其导电性能可刺激新的神经产生和功能性神经网络的形成，利于受损脊髓的修复[48]。虽然关于电刺激促进神经元再生的具体机制尚不明确，但已有研究开始对电压依赖性钙通道的作用[49]、细胞外基质成分局部电场变化的作用[50]和神经营养因子的释放依赖电刺激调节的作用[51]进行研究。

在水凝胶的相关应用中，还有另一个重要领域是研究神经调节装置，其已被用于制造可植入大脑或脊髓的电极和电路。在神经电极上覆盖由海藻酸盐与聚吡咯或聚（3,4-乙撑二氧噻吩）制成的水凝胶，可降低电阻，从而得到更好的神经检测结果[52-53]。另外，由聚（3,4-乙撑二氧噻吩）-聚苯乙烯磺酸盐制成的导电水凝胶也已被用于开发“可伸展电极”，这种电极的电荷存储能力更高，可用于长时间的神经刺激[54]。

4 结语

神经组织工程是组织工程中的一个新兴领域，目的是制造出能促进神经组织生长的模拟体内环境的人工材料。尽管已开发出了一些较为理想的水凝胶系统，可促进神经元的修复和再生，但其距离临床转化还相差很远。对神经再生生物学基本原理的研究，有利于基质支架的结构设计，从而开发出与生理环境更相似的系统。从转化的角度看，多从患者体内再生环境出发考虑修复策略，可能会增加神经组织工程成功的可能；根据神经系统的复杂特性，综合考虑基质硬度、导电性、药物释放等情况并选择最适条件施用，成功概率会更大。从更远的角度看，随着科技不断进步，对一些如记忆、性格和行为等在脑部核心区域的高级功能的研究将受到关注。

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