水产品糖蛋白的分离分析研究进展*

顾 盼，翟子扬，祁艳霞，赵前程

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116000)

海洋是生命的故乡，不仅有丰富的水资源，而且蕴藏着宝贵的能源[1]，中国有黄海、渤海、东海、南海四大海域，海域辽阔，水产品种类丰富，有巨大地开发利用潜力，前景广阔。我国是水产品养殖大国，2017年水产品全年出口量达433.94万吨，出口额211.50亿美元，同比分别增长2.40%和1.99%[2]。水产品养殖种类丰富，其中贝类养殖产量占养殖总产量的80%，是海洋养殖业的重要组成部分[3]。水产品不仅营养丰富味道鲜美，而且还具有多种生理功能，如抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力和抗氧化等[4-5]。这些生理功能与水产品中的糖蛋白有着密切的关系。因此，本文回顾了近年来水产品糖蛋白的研究进展，以期为水产品糖蛋白结构和功能的研究提供参考依据。

糖蛋白(glycoprotein)是体内重要的生物大分子，是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的一种结合蛋白质，在大多数情况下，糖含量低于蛋白质含量，并且糖链作为缀合蛋白质的辅基，广泛存在于生物体中[6]，蛋白质糖基化是最重要的翻译后修饰之一，对于蛋白质的折叠、构象稳定和活性等方面具有重要影响[7]。目前，随着基因组学技术的发展，有研究预测生物体内有50%以上的蛋白质发生了糖基化[8]。糖蛋白同时具有糖和蛋白质的性质，大多可溶于水、稀酸、稀碱和盐溶液中，但要注意在提取过程中必须保证糖蛋白分子的完整性，防止过酸、过碱、高温以及剧烈的机械作用等对糖蛋白分子的破坏，使其失去活性。

1 糖蛋白的提取

1.1 盐溶液浸提法

糖蛋白在稀盐和缓冲盐溶液中具有良好的稳定性和溶解度性，通常将氯化钠溶液做浸提液，这主要因为溶液中存在的盐离子可以与蛋白质结合起到保护作用，蛋白质不易变性便于提取。刘淑集等[9]以翡翠贻贝为原料，确定最佳提取条件为氯化钠浓度0.2 mol/L，料液比1:1，提取时间61 min，提取温度62 ℃，该条件下糖蛋白的提取率为51.55%。范秀萍等[10]从珠母贝全脏器中进行糖蛋白分离，结果表明最佳分离提取条件为：浸提剂为浓度1.0 mol/L的NaCl溶液，料液比为1:10，65 ℃下浸提60 min，此时珠母贝糖蛋白得率为3.37%。戴宏杰[11]以虎斑乌贼为研究对象，确定了最佳提取条件：氯化钠浓度3.8 mol/L，料液比1:20，提取时间1.5 h，提取温度66 ℃，虎斑乌贼肌肉糖蛋白提取率为7.87%。章建设等[12]以鱿鱼内脏为原料，确定提取工艺为：NaCl溶液浓度为3%，料液比为1:6、浸提时间为60 min、浸提温度为80 ℃，此条件下糖蛋白得率最高。李雨哲等[13]从马氏珍珠贝中进行糖蛋白的提取，确定其最佳提取条件：pH 7.2的1.0 mol/L的NaCl溶液，料液比1:2进行冰浴，4 ℃下离心过滤得到糖蛋白提取液。何晓梅等[14]以三角帆蚌脏器为原料，以0.3 mol/L NaC1溶液为提取溶剂，浸提温度4 ℃、料液比1:15、浸提时间9 h，此条件下糖蛋白得率大于3%。

1.2 水浸提法

由于糖链的多羟基结构具有高度亲水性，糖蛋白或糖肽在水中极易溶解，所以可采用水来提取各种糖蛋白或糖肽。该方法操作简便，根据糖蛋白的来源和性质不同提取条件也略有差异。黄来珍等[15]对近江牡蛎采用料液比1:4，水浸提时间120 min，温度4 ℃，高速离心取上清液超滤浓缩，得到糖蛋白，其中总糖含量1.19%，可溶性蛋白含量2.18%。范秀萍等[16]以波纹巴非蛤为研究对象，水作浸提剂提取糖蛋白，提取条件为：料水比为1:10，浸提温度80 ℃，浸提时间60 min，60 ℃条件下旋转蒸发浓缩。冯晓梅等[17]对牡蛎采用料水比1:1低温提取，水浸提时间120 min，温度4 ℃，离心后冻干得到糖蛋白粗提物。郁迪等[18]以菲律宾蛤仔肉为原料，料液比1:3，90 ℃浸提，第一次浸提4 h，第二次浸提3 h，两次浸提溶液混合醇沉并冷冻干燥得粗提物，纯化后得到糖蛋白。夏光华等[19]以鲫鱼卵为原料，采用水浸提的方法提取糖蛋白，料水比1:1浸提30 min，高速离心取上清液加入等体积的90%苯酚溶液搅拌2～3 h，二次离心得到粗糖蛋白。

2 糖蛋白的富集

水产品是复杂的生物体系，糖蛋白丰度低，而且后续的检测中容易受到其他非糖基化蛋白质的干扰，所以对糖蛋白进行分离富集，去除干扰组分，对后续糖蛋白的分析检测具有十分重要的意义。

2.1 凝集素亲和层析法

凝集素亲和层析法是将凝集素以共价形式与不溶性载体相连接作为亲和吸附剂的层析技术。适用于从混合物中分离或分析多糖、糖蛋白、细胞膜碎片、酶、抗体复合物等糖类及糖复合物。凝集素是一类糖结合蛋白，能特异性识别并结合单糖或聚糖结构中特定的序列，它们与糖链的结合既是非共价又是可逆的，因此在凝集素捕获糖蛋白或糖肽后，可以通过特定的单糖与凝集素的竞争性结合将糖蛋白或糖肽洗脱下来。主要分成一种凝集素、多种凝集素或连续凝集素亲和层析三种方法，一种凝集素亲和方法操作简单但相对的仅能富集特定的糖蛋白或糖肽，多种凝集素法可以富集较复杂的糖蛋白，实验技术相对成熟、操作简单、重复性好。凝集素亲和法应用灵活多样，植物凝集素最为常见如：刀豆素A、麦胚素、花生凝集素和大豆凝集素等。Wang[20]结合了多种凝集素的特异性，发展了一种包含刀豆凝集素，麦芽凝集素和木菠萝凝集素三种凝集素的富集检测血清中蛋白的策略，该技术已成功应用于人血清的蛋白质分析，并且发现了人类血清的蛋白质都是糖基化的。Liu等[21]以氧化葡聚糖作为间隔物促进合成了硅基材料伴刀豆球蛋白凝集素，并证实了该凝集素亲和富集糖蛋白和糖肽具有良好的效果。刘玲[22]以鲢鱼Ⅳ期卵为原料提取到半胱氨酸蛋白酶抑制剂粗提液，纯化分级得到具有较高活性的组分，该活性部分经刀豆凝集素Sepharose 4B亲和层析富集纯化后确定其为糖蛋白。

2.2 酰肼化学法

酰肼化学法是利用糖蛋白或糖肽上糖链的顺式邻二羟基结构与高碘酸反应生成醛，醛基可以特异性地与酰肼树脂上的氨基反应形成共价键，从而被酰肼树脂捕获，并利用PNGase F酶或胰蛋白酶将糖肽从酰肼树脂上释放，得到富集后的糖基化肽段。酰肼化学反应特异性高有助于糖基化位点的确认，并且洗脱过程中蛋白质损失小，但该方法反应步骤多操作复杂，且条件难以控制。Zhang等[23]对人血清中的质膜蛋白利用酰肼化学法进行分析鉴定和定量糖肽。Sudhir等[24]采用酰肼法从人支气管上皮细胞富集糖蛋白，并采用液相色谱-质谱联用分析，在人支气管上皮细胞中鉴定到了317个N-连接糖蛋白含608个N-连接糖基化位点。

酰肼法和凝集素富集法是糖蛋白富集应用较广泛的两种技术，有报道认为两种方法互补使用可以提高糖基化位点的鉴定数目，但也有研究表明两种方法并未显示出显著的互补性。虽然酰肼法的糖肽富集效率较凝集素富集法高，但是凝集素法鉴定到的糖蛋白和糖基化位点数目却较酰肼法高[25]。

2.3 亲水相互作用色谱法

由于糖链的多羟基结构具有高度亲水性，因此许多亲水性的层析介质可以用于糖蛋白或糖肽的富集，如纤维素[26]和琼脂糖[27]。该方法可以富集各种类糖肽，操作简便，但是不可避免的会有非特异性吸附，不能有效区分不同类型的糖肽或者糖蛋白，从而影响后续分析的准确性[28]。叶志国[29]以菲律宾蛤仔全脏器为研究对象进行糖蛋白的提取，粗糖蛋白经DEAE-52纤维素、Sephadex-G100柱层析分离纯化，得到中性糖蛋白GP-1和酸性糖蛋白GP-2二个主要组分。秦玉青[30]从雌性扇贝生殖腺脱脂后提取糖蛋白，经DEAE-纤维素柱盐析、透析、Sephadex-G100纯化及冷冻干燥后，得到中性糖蛋白(FNGP)和酸性糖蛋白(FAGP)。近年来，基于亲水材料的萃取技术得到了一定的发展，在琼脂糖、多聚酰胺等传统材料的基础上[31-32]，又出现了两性离子-亲水作用色谱材料[33]和基于点击化学的亲水作用色谱填料[34]，显著增加了亲水作用色谱对糖基化肽段富集的特异性和富集倍数，促进了亲水作用色谱在蛋白质糖基化位点规模化分析中的应用。此外，结合质谱分析，亲水作用材料能够用于完整的糖基化肽段鉴定和定量[35-36]，亲水作用色谱在糖基化蛋白质组学分析中具有重要的价值。

2.4 硼酸亲和层析法

硼酸亲和技术是利用硼酸基团与糖肽中糖链上的顺式二羟基的可逆反应形成环状二酯，并且通过这种共价配位作用实现目标物的分离和纯化。在碱性条件下，硼酸基团可与顺式二羟基结构相互作用形成稳定的五元环络合物，分子被介质吸附；在酸性条件下络合的部分被打开，分子从介质上解吸。硼酸亲和层析法可以用于分离纯化带有顺式二羟基结构的化合物，例如：糖蛋白、核苷、核苷酸、糖类等。该方法操作简单只需改变pH值，优化后可以洗脱非特异性吸附，专一性和普适性强[37]。Ren等[38]使用亲水性的交联剂通过原位聚合反应以制备了亲水性的硼亲和整体柱，该硼亲和整体柱被成功的用于糖蛋白的富集。Luo等[39]用氨基苯硼酸修饰二维单层氧化石墨烯后结合卵清蛋白，经溶胶—凝胶法在其表面包覆一层有机硅，去除模板蛋白后得到了对卵清蛋白有双重识别能力的硼亲和印迹材料，其结合位点同时具有硼亲和配基以及与卵清蛋白结构相匹配的形状，能排除糖蛋白卵铁传递蛋白的干扰，从鸡蛋清中特异性选择富集卵清蛋白，极大地提高了硼亲和材料的选择性。

3 糖蛋白的结构性质分析

3.1 传统分析方法

传统分析方法主要针对纯化的单一组分的糖蛋白。确定一种物质的结构主要有以下几点：分子量大小、单糖组成、α-、β-异构体、环状结构及糖苷键类型等情况。根据寡糖链和蛋白质连接类型的不同，可分为N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化以及糖基磷脂酰肌醇锚糖基化(GPI-Anchor)四种连接形式[40]，其中N-糖基化、O-糖基化两种连接形式最为常见。对于提取到的糖蛋白传统分析方法主要从糖蛋白的等电点测定、气相色谱法、红外光谱分析、β-消除反应和紫外光谱分析等几方面进行。糖蛋白可分为酸性糖蛋白和碱性糖蛋白，酸碱性可通过其等电点的pH值来确定，糖蛋白糖链的单糖组成可通过气相色谱技术进行鉴定。红外光谱分析可以测定糖蛋白环状结构的类型、异头异构体，红外吸收峰的位置与强度反映了分子结构上的特点，可用于识别物质的结构组成或确定其化学基团，而吸收谱带的吸收强度与化学基团的含量有关。β-消除反应主要用来确定糖蛋白的糖苷键类型，N-糖苷键和O-糖苷键这两种最为常见，前者对碱稳定，后者易被碱打开[41]。O-糖苷键被碱打开后，在糖肽连接处若为丝氨酸即转变成α-氨基丙烯酸，若为苏氨酸，则转变成为α-氨基丁烯酸，二者均在240 nm下具有特征性紫外吸收[42]。

冯晓梅[17]对从青岛牡蛎提取到的糖蛋白组分F22进行相关性质的研究，结果表明F22是酸性糖蛋白，等电点为pH 5.5，红外光谱分析显示具有酰胺键特征吸收峰，F22的中性单糖是由葡萄糖这一种单糖组成的同多糖，由15种氨基酸所组成，其中缬氨酸在总氨基酸中占比最大，相对含量达到37.7%；其次为甘氨酸，其相对含量达到了10%以上，该糖蛋白是β-折叠结构，糖苷键类型为吡喃型，糖肽键类型为N-糖肽键。徐明生等[43]从河蚬中提取到糖蛋白，经鉴定该糖蛋白相对分子量19030 D，存在O-糖肽键，具有多糖的特征吸收，含有吡喃糖β-型糖苷键。包郁明[44-45]针对皱纹盘鲍脏器提取得到的糖蛋白进行系统的结构分析，结果表明该糖蛋白含有8种单糖，17种氨基酸，同时鉴定到该糖蛋白是β-折叠结构，糖苷键类型为吡喃型，糖肽键类型为O-糖肽键。迟长凤等[46]以贻贝为原料提取糖蛋白，通过分析表明贻贝糖蛋白的分子量约为16.9 kDa，含有O-糖苷键和N-糖苷键，糖和蛋白含量分别为23.54%和76.46%，由15种氨基酸组成，单糖的组成比例为D-葡萄糖:L-阿拉伯糖:D-半乳糖:D-果糖:D-甘露糖=1.00:2.01:6.93:7.27:4.05。陈银[47]以黑鱼鱼卵为原料提取糖蛋白，经鉴定黑鱼糖蛋白含有N-糖苷键和O-糖苷键，单糖组成为甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.20:1.00:12.22。徐永健等[48]以大海马为原料提取粗糖蛋白，经纯化分级得到2个组分HG-11和HG-21，HG-11有15种氨基酸，HG-21有16种氨基酸，两组分中的单糖有甘露糖、核糖、葡萄糖和半乳糖四种，鉴定到该糖蛋白是通过O-糖苷键连接的并且具有α螺旋结构，糖苷键是α型吡喃糖。

3.2 蛋白质组学分析方法

对于复杂生物体系中提取富集出来的的混合糖蛋白，采用蛋白质组学技术可以对其有较好的分析能力，蛋白质的糖基化位点可以通过蛋白质组学的方法来确定，目前蛋白质组学的新技术包括双向凝胶电泳[49]、蛋白质芯片[50]、酵母双杂交、同位素标记亲和标签(isotope coded affinity tags，ICAT)和液相色谱—质谱联用技术[51]。双向凝胶电泳该技术是分析和检测来自复杂生物蛋白质的有力工具，根据等电点和分子量的不同来分离蛋白质[52-53]。蛋白质芯片是一种蛋白质组检测技术，具有高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点，可用于检测混合物中单个蛋白质与他们相对应的识别物间的相互作用[54]。液相色谱-质谱(High performance liquid chromatography -mass spectrometry，HPLC-MS)联用技术基本原理是先采用液相色谱将不同的糖肽进行分离，然后进入质谱。在质谱中首先将样品离子化带上电荷，然后带电粒子经加速电场的作用，形成离子束并进入质量分析器，在质量分析器中，电场或磁场可以在空间或时间上对不同质荷比的离子进行分离，或是透过过滤的方式，将它们分别聚焦到检测器上，从而获得质量与浓度(或分压)相关的图谱，最后是数据库检索，即将质谱所得的实际图谱与肽段碎裂产生的理论图谱进行对比以确定肽段序列及其归属的蛋白质[55]，HPLC-MS技术因其操作简单准确度高的特点成功地用于糖肽或糖蛋白的结构分析[56-57]。

糖蛋白质组学研究主要包括定性和定量两个方面，定性主要是对于蛋白质的确定、糖基化位点的鉴定，以及完整的糖链信息三方面进行解析，其中糖基化位点的鉴定在糖蛋白解析中显得至关重要，因为完整糖基化肽的二级谱图非常复杂，所以不能直接搜索数据库[58]。目前最常见最成熟的方法是通过内切糖苷酶切除糖链并在糖基化位点引入一定质量差异，将PNGase F作用在氨基酸与五糖核心中第一个GlcNAc之间，酶切后使得糖基化位点的天冬酰胺(AsnN，114.043 Da)转变为天冬氨酸(AspD，115.027 Da)造成相对分子量增加0.98 Da，从而起到糖基化位点质量标签的作用被质谱检测到[59-60]。定量主要是对于生物样本中糖基化程度进行相对或绝对定量，相对定量又分为非标定量和标记定量两种。在非标定量策略中，蛋白或肽段通过一级质谱或串级质谱信号强度、谱峰面积及谱图数进行定量。同位素标记定量时给肽段引入一个稳定的同位素标记，使得肽段分子量发生改变，通过比较不同同位素标记的肽段的丰度从而对蛋白进行定量。常用的同位素标记方法包括化学反应法、代谢标记法以及酶促标记法。化学标记法中常用的有ICAT (isotope-coded affinity tags)和ITRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)技术[61]。

陈宁等[62]从刺参水煮液提取到糖蛋白粗制品，得到了分子质量分别为964.3 kD和2.5 kD的两种糖蛋白，通过液相色谱—质谱技术确定其含有氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖6种单糖，含有18种氨基酸，包括8种人体必需氨基酸，半必需氨基酸组氨酸的含量占比最高，还鉴定出该糖蛋白含有酸性黏多糖物质。王晓斐[63]以中国对虾为研究对象，经免疫印迹确定过敏原组分为Pen c 1，结构分析的结果表明Pen c 1是分子量为36 kD的糖蛋白，蛋白质二级结构为α-螺旋，含有D-甘露糖和D-葡萄糖，存在O-糖苷键，经质谱分析表明122位天冬酰胺为Pen c 1的N-糖基化位点，第101位苏氨酸为潜在的O-糖基化位点。液相色谱-串联质谱技术也被广泛应用于糖蛋白的检测，李凤等[64]采用液相色谱-串联质谱法分析新红细胞生成刺激蛋白的肽质量指纹图谱和糖肽结构，根据MS/MS碎片信息，结果显示出3种类型的O-糖肽，其糖链组成为GalNAcGal(Neu Ac)_2、GalNAcGal(NeuAc)_1和GalNAcGal。江静等[65]采用自制的亲水固相萃取富集柱和生物质谱鉴定技术，对糖基化蛋白质核糖核酸酶B进行系列分析。结果表明：其糖基化位点为34位的Asn，糖链主要为5种高甘露糖型结构(Man5-9GlcNAc2)。侯向昶等[66]采用超高效液相色谱-串联质谱技术对燕窝中唾液酸含量进行测定，结果显示五种不同的燕窝唾液酸含量在6.0%～8.5%之间。同时刘彦品[67]也利用该技术测定奶粉中唾液酸含量，该方法前处理简单、快速、重复性好、灵敏度高，可广泛用于母乳、牛乳和奶粉中唾液酸含量的测定。

4 结 语

水产品糖蛋白具有复杂的结构和化学性质，根据结构与性质的不同可以采用不同的提取富集方法，但目前各种先进的糖蛋白富集分析的方法多是针对于人体血液等组织的检测，应用于水产品糖蛋白的分析相对较少。随着水产品糖蛋白结构性质的研究深入，将会有更多更好的技术应用于水产品糖蛋白的分离分析。每种提取和富集的方法各有利弊，综合来看，在研究过程中最好可以结合不同方法的优势，采用多种方法相结合来进行更有效更全面的提取、富集分离、分析水产品糖蛋白。我国有丰富的海洋资源，为我们对水产品糖蛋白的研究提供了便利，但目前对其结构的研究较少，今后应基于蛋白质组学和糖组学的先进技术手段加强对糖蛋白的结构和功能的深入研究。