广藿香醇通过调控上皮间质转化抑制人胃癌细胞HGC-27的侵袭和转移

闵 琼，曾海荣，陆翠燕，张夏炎*

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.上海市普陀区中心医院药学部，上海 200062；3.上海市普陀区中医医院药剂科，上海 200062)

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在2018年全球恶性肿瘤中分别占5.7%和8.2%，分别位于第5位和第3位[1]。我国是胃癌高发病国家，胃癌的发病人数和死亡人数约占全球一半，胃癌也是重点防治的癌种之一[2]。胃癌的浸润和转移是导致患者死亡的主要原因，而大多数胃癌在确诊时已发展至中晚期，发生转移，这也成为胃癌防治的瓶颈问题[3]。上皮间质转化 (epithelial mesenchymal transition,EMT)在肿瘤的进展，尤其是肿瘤浸润和转移过程中起着非常重要的调节作用[4]。在胃癌的发展进程中，胃癌细胞逐渐失去其上皮特性，获得间充质细胞特性，即发生EMT，从而使胃癌细胞的侵袭、转移能力增强。目前，胃癌的防治主要以手术和化疗为主，虽然近年来靶向治疗和免疫治疗也越来越受到重视，但由于价格昂贵，在临床的使用受到限制[5]。因此，寻找高效、低毒、价格实惠的胃癌化疗新药物具有重要意义。广藿香醇是从唇形科刺蕊草属植物广藿香[Pogostemoncablin(Blance) Benth.]中提取的挥发油，具有保护胃肠道、抗病毒、解热镇痛、镇吐止咳、抗肿瘤及调节免疫系统等药理学作用。研究发现，广藿香醇对以应激性腹泻为主要症状的肠易激综合征有抑制作用[6]，体外对人结直肠癌细胞具有抗肿瘤活性[7]。因此，本研究观察了不同浓度广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27增殖、侵袭和迁移的影响，并对其作用机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 仪器 CO2细胞培养箱、高速低温离心机和多功能酶标仪(美国Thermo公司)；电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；电子天平(德国Sartorius公司)；流式细胞仪(美国FACS Calibur,Becton Dickinson公司)。

1.2 试药和细胞 广藿香醇(纯度>98%，批号MUST-17073111，成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM细胞培养基(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma-Aldrich公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；Immobilon ECL发光液、Pierce BCA蛋白检测试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；一抗E-cadherin、N-cadherin、β-Catenin、Vimentin、β-Actin(美国Cell Signaling Technology公司)；Transwell 小室(美国Corning公司)。人胃癌细胞株HGC-27(批号 153255，中国科学院细胞库)。

1.3 细胞培养 人胃癌细胞株HGC-27用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基置于37 ℃、5%CO2恒温细胞培养箱中进行培养，细胞生长至约80%即可，用 0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，进行细胞传代。细胞平均2～3 d 传代一次。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM完全培养基稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/ml，将细胞悬液以100 μl/孔接种于96孔板上，每组 3个复孔，外围一圈边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)填充。细胞培养过夜，等细胞贴壁生长后，将孔内的培养基换成含不同浓度广藿香醇(0、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L)的DMEM完全培养基。分别于加药24和48 h后加入MTT溶液(终浓度为5 mg/mL)，4 h后弃去上清液，加入150 μl的DMSO，振荡10 min溶解结晶，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度，计算抑制率和IC50值。抑制率=[1-(药物干预组吸光度/对照组吸光度)]×100%。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM完全培养基稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为2×104个/ml，将2 ml细胞悬液接种于6孔板，待细胞铺满孔底，用黄枪头在6孔板里竖着划痕，然后用无菌PBS清洗2遍，除去细胞碎片。分别加入广藿香醇 (20、40 μmol/L)，于0、24、48 h在显微镜下拍照，观察细胞愈合情况。

1.6 Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力 细胞经不同浓度广藿香醇作用24 h后，用无血清培养基重悬成单个细胞，以1×105个/孔接种于Transwell上室，下室加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，取出小室，上室细胞用棉签轻轻擦去，下室放入4%多聚甲醛溶液中固定15 min，再用1%结晶紫染色10 min。取出小室，在清水中荡洗，空气中晾干。用显微镜拍照观察，并用Image J进行细胞计数。Transwell侵袭实验需要先对小室用Matrigel基质胶进行包被，将Matrigel基质胶从-20 ℃冰箱取出，放4 ℃冰箱过夜融化，然后将Matrigel基质胶与无血清培养基按1∶6进行稀释，吸取100 μl加入小室上层，于37 ℃放置2～3 h。待Matrigel基质胶凝固后，弃去残余液体，其他操作步骤与Transwell实验检测细胞迁移能力操作步骤相同。

1.7 用Western印迹法检测EMT相关蛋白表达 收集经广藿香醇 (20、40 μmol/L)处理 48 h的细胞，在冰上用RIPA裂解液进行裂解，在4 ℃以相对离心力8 000×g离心 10 min，收取上清液。用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，100 ℃ 金属浴10 min使蛋白变性。冷却后经SDS-PA凝胶电泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转膜，将膜用洗膜液清洗，然后用5%脱脂奶粉封闭，室温下放置1 h。一抗 4 ℃孵育，过夜，用洗膜液洗3次，每次10 min。二抗室温下孵育1 h，用洗膜液充分洗涤后，ECL显影液进行显色，采用凝胶成像系统拍照，并用灰度分析软件对各条带进行定量分析。

2 结 果

2.1 广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27增殖的影响 不同浓度广藿香醇作用24和48 h对人胃癌细胞HGC-27的生长抑制率见图1。广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27具有增殖抑制作用， 且呈现一定的时间和浓度依赖性。不同浓度的广藿香醇 (0、1、5、10、20、50、100 μmol/L)作用于细胞24和48 h后，随着药物浓度升高和作用时间延长，其抑制率也增强。广藿香醇作用24 和48 h的IC50分别为38.9和18.9 μmol/L。根据MTT法测定结果，选择广藿香醇浓度为20和40 μmol/L进行后续实验。

图1 不同浓度广藿香醇作用24和48 h对人胃癌细胞HGC-27的生长抑制率Figure 1 Inhibitory rates of different concentrations of patchouli alcohol on the growth of human gastric cancer cells HGC-27 at 24 and 48 h○：作用24 h；●：作用

2.2 广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27迁移能力的影响 划痕实验考察不同浓度的广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27迁移的影响，结果见图2，20和40 μmol/L的广藿香醇作用于胃癌细胞HGC-27 24和48 h后能够显著抑制细胞迁移，减少划痕的愈合面积。Transwell迁移结果见图3，由图3可见，与空白组比较，广藿香醇(20和40 μmol/L)作用48 h后，细胞的迁移数量显著减少(P<0.05)。划痕实验和Transwell实验结果表明，广藿香醇能够显著抑制胃癌细胞HGC-27的迁移。

2.3 广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27侵袭能力的影响 Transwell实验结果显示， 广藿香醇能够明显降低胃癌细胞HGC-27的侵袭能力， 抑制胃癌细胞HGC-27的转移。 与对照组比较， 20和40 μmol/L的广藿香醇作用于细胞48 h后， 细胞的侵袭数量显著减少(P<0.05)。 见图4。

2.4 广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27 EMT相关蛋白表达的影响 Western印迹法结果见图5，由图5可见，广藿香醇(20和40 μmol/L)分别作用于人胃癌细胞HGC-27 48 h后，上皮标志物E-cadherin的蛋白表达显著升高，与对照组相比，分别升高至1.33倍和1.48倍，具有显著性差异(P<0.05)；上皮间质标志物N-cadherin、β-Catenin、Vimentin的蛋白表达均下降，其中N-cadherin分别下降至原水平的0.75%和0.53%，β-Catenin分别下降至原水平的0.58%和0.32%，Vimentin分别下降至原水平的0.69%和0.47%，具有显著性差异(P<0.05)。

图2 划痕实验中不同浓度的广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27迁移的影响Figure 2 The effects of different concentrations of patchouli alcohol on the migration of human gastric cancer cell HGC-27 by scratch testA：对照组(作用0 h)；B：对照组(作用24 h)；C：对照组(作用48 h)；D：20 μmol/L广藿香醇组(作用0 h)；E：20 μmol/L广藿香醇组(作用24 h)；F：20 μmol/L广藿香醇组(作用48 h)；G：40 μmol/L广藿香醇组(作用0 h)；H：40 μmol/L广藿香醇组(作用24 h)；I：40 μmol/L广藿香醇组(作用48 h)

图3 Transwell实验中不同浓度的广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27迁移能力的影响Figure 3 The effects of different concentrations of patchouli alcohol on the migration of human gastric cancer cell HGC-27 by Transwell testA：对照组；B：20 μmol/L广藿香醇组；C：40 μmol/L广藿香醇组；D：迁移细胞数量；*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较

图4 Transwell实验中不同浓度的广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27侵袭能力的影响Figure 4 The effects of different concentrations of patchouli alcohol on the invasion of human gastric cancer cell HGC-27 by Transwell testA：对照组；B：20 μmol/L广藿香醇组；C：40 μmol/L广藿香醇组；D：侵袭细胞数量；**P<0.01，与对照组比较

图5 不同浓度广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27 EMT相关蛋白表达的影响Figure 5 Effects of different concentrations of patchoulil alcohol on expression of EMT-related proteins in human gastric cancer cell HGC-27

3 讨 论

广藿香醇是从广藿香植物中分离得到的一种三环倍半萜类化合物，生理活性较强，能够调节胃肠运动，保护肠黏膜屏障，具有抗炎、镇痛、免疫调节及抗肿瘤等作用，对消化道疾病具有很好的疗效，以广藿香为原料的药品在临床上广泛使用。研究显示，广藿香醇能有效抑制结肠癌细胞HCT116、SW480[7]及前列腺癌细胞DU145[8]的生长，抑制细胞转移，发挥抗肿瘤作用，但其确切的作用机制尚不明确。本研究考察了广藿香醇对人胃癌细胞HGC-27增殖、侵袭和转移的影响，MTT检测结果表明，广藿香醇能抑制HGC-27细胞增殖；划痕及Transwell实验结果表明，广藿香醇能抑制HGC-27细胞的侵袭和转移能力，提示广藿香醇对胃癌的复发、转移具有潜在疗效。

EMT是肿瘤研究的热点，肿瘤细胞从病灶部位脱落是发生浸润、转移的第一步，脱落的细胞穿过血管，随血液运行，转移到其他部位；穿透血管是其浸润、转移的第二步，而穿过血管的能力依赖于细胞发生EMT[9]。EMT是以上皮标志物E-cadherin的表达减少而间充质标志物N-cadherin和Vimentin等表达增多为特点的过程，期间细胞发生形态、黏附力及活力改变，有助于细胞脱落，穿透血管，从而发生转移[10]。

有研究报道，广藿香醇可能通过抑制M2型丙酮酸激酶(PKM2)磷酸化和核因子-κB(NF-κB)的表达而诱导人白血病细胞MV4-11凋亡[11]。与其机制不同的是，本研究发现，广藿香醇在抑制HGC-27细胞侵袭、转移能力的同时，可降低E-cadherin的表达，同时升高N-cadherin、β-Catenin和Vimentin的表达，提示广藿香醇能够抑制HGC-27细胞发生EMT，从而抑制HGC-27细胞的侵袭和转移能力。肿瘤细胞中调控EMT的信号通路有多种，包括Hedgehog信号通路、Notch信号通路、Wnt3a/β-Catenin信号通路、Ras/EMK信号通路以及 PI3K/AKT信号通路等。激活AKT可以使细胞间黏附力降低、极性降低、运动能力增加，使上皮细胞和间充质细胞标志物的表达和分布发生变化[12]。茆文莉等[13]研究认为，薯蓣皂苷可能通过调控 PI3K/AKT 信号通路，抑制PI3K、AKT的表达及其磷酸化，从而抑制人肺腺癌细胞 H1299的EMT。本研究中，广藿香醇通过调控EMT而抑制胃癌细胞HGC-27发生侵袭、转移，但是具体的作用机制仍不清楚，有待进一步研究。