安徽省猪伪狂犬病毒的分离鉴定及其主要毒力基因分子特征

袁献宇，杨龙斌，何赞赞，毛天骄，何长生，占松鹤，孙 裴，魏建忠，李 郁，*

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽 合肥 230091)

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性、热性传染病，主要以仔猪致命性脑炎、育肥猪呼吸道症状及母猪流产为特征[1]。猪伪狂犬病对养猪业危害极大，在欧美等西方国家，通过使用标记疫苗和相应的鉴别诊断方法，很好地控制或根除该病[2]。20世纪末，随着PRV弱毒疫苗的使用，以及部分规模化种猪场实施猪伪狂犬病的根除净化计划，猪伪狂犬病在我国得到有效控制。但自2011年10月以来，我国超过20个省市规模化猪场暴发猪伪狂犬病，许多免疫过PRV弱毒疫苗的猪场也有发病报道，表明传统疫苗不能对流行的PRV变异株提供完全保护，PRV变异株与经典株间存在一定差异[3]。

PRV属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，成熟的病毒粒子为球形，直径180～300 nm，核衣壳呈二十面体对称，有囊膜和纤突，基因组为线性双链DNA，全长大约140 kb，平均G+C碱基含量约74%，编码约100种蛋白质。PRV的毒力由多种基因协同调控，主要包括gE、gI、TK、gB、gC、gD等基因[2，4，5]。gE基因是PRV的主要毒力基因之一，其编码糖蛋白，能引发细胞融合，对病毒侵染神经系统具有重要作用，同时也是PRV野毒株共有的非必需基因，缺失后可保持其免疫原性，降低病毒毒力[2，6]。gI基因编码的糖蛋白能与gE糖蛋白以共价键形式结合形成gI/gE复合体，促进病毒在细胞间传播。TK基因编码的胸苷激酶参与病毒的复制和潜伏感染，对病毒在宿主中枢神经系统中的复制起重要作用，TK基因缺失后，病毒毒力明显减弱。gB糖蛋白参与病毒在细胞间的传播，促进病毒的细胞融合过程，并诱导机体产生中和抗体[7]。gC糖蛋白能诱导细胞免疫，是病毒的主要中和抗原，并且在病毒吸附、释放等过程中起着重要的作用，gC基因的变化影响病毒在机体内的传播及中和抗体的产生[8]。gD糖蛋白能识别细胞表面受体并与之结合，介导病毒与宿主细胞的结合，是病毒复制和细胞融合所必需的结构蛋白，同时也是病毒主要的免疫原性蛋白之一。

本研究利用PCR技术、细胞接种试验、透射电子显微镜观察、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay，IFA)试验及兔体接种试验等方法对2016—2018年安徽省临床诊断病例中出现高热、呼吸道症状、神经症状、繁殖障碍、致命性脑炎等疑似PRV感染症状的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定，并对PRV分离株的gE、gI、TK、gB、gC及gD基因进行克隆、测序及相关生物信息学分析，旨在了解目前安徽省PRV流行株主要毒力基因的分子特征及遗传变异情况，为PRV分子流行病学研究及猪伪狂犬病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料的采集

病料来源于2016年1月至2018年12月安徽省不同发病猪场疑似感染PRV的病猪，所采集病料组织包括肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、扁桃体、脑组织等。

1.2 细胞及试验动物

Vero细胞由安徽农业大学动物传染病研究室保存；10周龄(2 kg左右)健康新西兰白兔由安徽医科大学动物试验中心提供。

1.3 主要试验材料

DL10000 DNA Marker、氨苄青霉素、TIAN Midi Purification Kit均购自TianGen公司；FlyCut®BamHⅠ、FlyCut®XhoⅠ、Trans5α Chemically Competent Cell、pEASY®-T1 Simple Cloning Kit均购自北京全式金生物技术有限公司；2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix购自北京康润诚业生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、FITC标记山羊抗猪二抗均购自北京百奥莱博科技有限公司；MicroElute Genomic DNA Kit购自OMEGA公司；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液(100×)、胰酶均购自Hyclone公司；PRV Bartha-K61疫苗株阳性猪血清由安徽农业大学动物传染病实验室制备并保存；猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)PCR检测试剂盒、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒、猪日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)RT-PCR检测试剂盒均购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank中登录的PRV全基因序列(BK001744.1)，使用Primer Premier 5.0及Oligo 6.0软件设计7对特异性引物(表1)，分别用于疑似PRV感染病猪组织核酸(gE-JC)检测及PRVgE、gI、TK、gB、gC、gD全基因扩增。引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.5 病原筛查

根据病猪临床症状及背景信息，参照北京世纪元亨病原检测试剂盒操作说明，提取病料组织核酸并利用RT-PCR方法进行CSFV、PRRSV、JEV病原检测，利用PCR方法进行PCV2、PPV病原检测；利用引物gE-JC进行PRV核酸鉴定，PCR反应体系为25 μL，包括2×SuperStar Plus High-GC PCR Mix 12.5 μL、双蒸水5.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板5 μL。扩增结束后在凝胶成像系统中观察电泳结果。

1.6 病毒分离鉴定

1.6.1 病毒分离

病料组织研磨离心后的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，加入青霉素、链霉素溶液至最终浓度分别为300 U·mL-1、100 μg·mL-1，过夜孵育，取处理后的上清液800 μL接种致密单层Vero细胞，于37 ℃ CO2恒温培养箱中吸附1 h，结束后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃ CO2恒温培养箱中培养，持续观察Vero细胞的细胞病变(cytopathic effect，CPE)情况，当CPE达到80%时收集病毒液，提取病变细胞DNA，PCR法进行PRV核酸鉴定。

1.6.2 病毒形态观察

收集出现CPE现象的Vero细胞，反复冻融3次后4 ℃ 3 000 r·min-1离心30 min，取上清液4 ℃ 25 000 r·min-1超速离心3 h，用少量PBS缓冲液将沉淀溶解，溶解后的沉淀通过蔗糖密度梯度离心进行病毒纯化，纯化后的病毒液送至武汉谷歌生物科技有限公司进行透射电子显微镜观察。

1.6.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

将纯化后的病毒液分别接种Vero细胞，培养约12 h后弃去培养液，用600 μL多聚甲醛4 ℃固定30 min，清洗后加入5% BSA封闭液37 ℃作用30 min，弃去封闭液，用PBST洗液清洗3遍。试验组加入600 μL PRV阳性猪血清，对照组加入等量PBS溶液，37 ℃孵育1 h。洗涤后用FITC标记山羊抗猪二抗(1∶1 500)37 ℃避光孵育1 h，吸弃二抗，清洗后置于荧光倒置显微镜下观察。

1.6.4 动物实验

选取10周龄gB、gE抗体均为阴性的健康新西兰白兔，试验组白兔分别经颈部皮下接种1 mL纯化后的病毒液(病毒滴度为106TCID50·mL-1)，对照组注射相同体积的PBS缓冲液，隔离饲养，持续观察记录健康状况。出现明显的临床症状后，剖检观察病理变化，并进行组织核酸PCR检测。

1.7 PRV主要毒力基因的克隆及分析

以PRV核酸为模板进行gE、gI、TK、gB、gC及gD基因扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收后，连接pEASY-T1克隆载体构建重组质粒。经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒送于上海桑尼生物科技有限公司进行测序，每个样本测序2次。利用MEGA 7.0、DNAMAN等软件对测序所获得的序列与GenBank已登录的gE、gI、TK、gB、gC和gD基因序列进行比对分析，并构建各基因核苷酸序列遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 病原筛查结果

提取组织中病毒核酸，通过RT-PCR、PCR扩增技术对CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2、PRV等病原进行检测。结果显示，病料中仅检出PRVgE特异性核酸阳性条带(图1)，其他所检项目均为阴性。

M，2 000 bp DNA marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3～4，PRV gE。M，2 000 bp DNA marker；1，Positive control；2，Negative control；3-4，PRV gE.图1 PRV gE基因检测结果Fig.1 Test results for gE of the PRV

2.2 病毒分离与传代

15份病料组织上清液接种Vero细胞后，其中有4份上清液接种24 h后细胞开始脱落，5份上清液接种细胞传至第二代48 h后细胞出现圆缩、聚集、融合、脱落等现象，其他6份上清液接种后盲传至第三代时开始出现细胞圆缩、融合、拉丝状，随后大面积脱落现象。15株病毒传至第五代后均使细胞可在12 h内稳定的出现细胞病变(图2)。从细胞培养液中扩增到目的片段，表明从病料中分离出疑似PRV。

2.3 病毒形态观察结果

对超速离心纯化后的病毒负染后进行电镜观察，可以观察到疱疹病毒典型的病毒粒子形态(图3)。病毒粒子呈球形，直径为150～200 nm，体积较大，囊膜厚，核芯致密，囊膜表面有放射状的纤突。结果显示，所观察的病毒粒子与PRV粒子形态大小基本一致。

A，接毒后48 h细胞；B，正常细胞。A，Vero cells 48 h post-inoculation with PRV；B，Normal Vero cells.图2 接种疑似PRV病毒后48 h的Vero细胞CPE(400×)Fig.2 CPE of Vero cells at 48-hour post-inoculation(400×)

图3 电镜下病毒形态观察结果Fig.3 Morphological identification of virus

2.4 IFA鉴定结果

将分离的15株病毒分别接种Vero细胞，进行IFA检测。结果显示，接种病毒的细胞的胞浆和胞核呈现明显的绿色荧光，对照组细胞未见绿色荧光(图4)。研究结果表明，病毒接种细胞均能与PRV阳性血清抗体特异性结合，进一步证实所分离的毒株为PRV。

2.5 兔接毒试验结果

接毒24～72 h，试验组15只新西兰白兔出现精神沉郁、食欲下降、烦躁不安、体温升高(约41 ℃)等现象，其中9只白兔出现奇痒、局部被毛脱落、角弓反张、啃咬接种部位等症状不久后死亡，少数发病兔仅出现躯体抽搐、四肢麻痹、呼吸急促等症状后死亡。对照组白兔精神状态良好，体温、采食等均正常。PCR检测结果显示，接种病毒的白兔组织PRV呈阳性，对照组呈阴性，表明从病料中分离的病毒为PRV。15株PRV背景信息及命名见表2。

A，接毒后12 h细胞；B，正常细胞。A，Vero cells 12 h post-inoculation with PRV；B，Normal Vero cells.图4 IFA鉴定结果(200×)Fig.4 IFA identification of virus(200×)

2.6 目的基因的克隆

对TK、gI、gD、gC、gE及gB全基因引物进行PCR扩增，15株PRV分别扩增出约980、1 184、1 248、1 480、1 780、2 877 bp的条带，与预期结果一致(图5)。扩增基因经比对显示，与目的基因序列最高相似度在99%左右，表明基因克隆成功。

2.7 PRV分离株gE、gI、TK、gB、gC及gD基因分子特征分析

2.7.1gE基因分子特征分析

15株PRV分离株gE基因核苷酸序列同源性在99.71%以上，与国内变异株位于同一分支，且部分分离株与湖北HNX株、河南HN1201株、江苏JS2012株、山东Qihe547株等变异株核苷酸序列同源性均为100%；与国内经典株(Ea株、Fa株等)位于不同小分支；与欧美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，亲缘关系较远(图6)。与国内经典株相比，PRV分离株与国内变异株存在高度一致的特征性变化，即在142～144位、1 488～1 490位均存在3个连续碱基的插入，分别是GAC和CGA(对应氨基酸序列48位和496位各有一个天冬氨酸的插入)；在54、161、228、1 342位均出现了一致的碱基替换，即G54D、G161A、G1342A、C228A，且1 342位碱基的改变导致其氨基酸序列发生变化。

表2 PRV分离株信息Table 2 Background information of the PRV isolates

M，10 000 bp DNA marker；1，TK基因；2，gI基因；3，gD基因；4，gC基因；5，gE基因；6，gB基因。M，2 000 bp DNA marker；1，TK gene；2，gI gene；3，gD gene；4，gC gene；5，gE gene；6，gB gene.图5 PRV TK、gI、gD、gC、gE、gB基因扩增结果Fig.5 PCR amplification of PRV TK， gI， gD， gC， gE， gB genes

2.7.2gI基因分子特征分析

15株PRV分离株gI基因核苷酸序列同源性在99.73%以上，与国内流行变异株位于同一分支，且部分分离株与湖北HNX株、河南HN1201株、江苏JS2012株、黑龙江HLJ8株等变异株核苷酸序列同源性为100%；与国内经典株(Ea株、Fa株、SC株等)位于不同小分支；与欧美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，亲缘关系较远(图7)。与国内经典株相比，PRV分离株与国内变异株仅在321、987位均出现了一致的碱基替换，即G321A、C987T(推导氨基酸序列未发生变化)，且部分分离株(AH1601、AH1602、AH1701等)与国内经典株Fa株、SC株氨基酸序列同源性为100%。

图6 gE基因遗传进化分析Fig.6 Phylogenetic trees for gE gene

2.7.3TK基因分子特征分析

15株PRV分离株TK基因核苷酸序列同源性在99.79%以上，与国内经典株(Fa株、LA株等)及国内变异株(江苏JS-2012株、湖北HNB株等)均位于同一分支，亲缘关系较近，且与经典株Fa株、湖北HNX株、河南HN1201株、江苏JS2012株、黑龙江HLJ8株等核苷酸序列同源性均为100%；与欧美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，亲缘关系较远(图8)。与国内参考毒株核苷酸及推导氨基酸序列比对未发现明显变化。

图7 gI基因遗传进化分析Fig.7 Phylogenetic trees for gI gene

图8 TK基因遗传进化分析Fig.8 Phylogenetic trees for TK gene

2.7.4gB基因分子特征分析

15株PRV分离株gB基因核苷酸序列同源性在99.89%以上，与国内变异株位于同一分支，且与湖北HNX株、河南HN1201株、天津TJ株、北京BJ-YT株、江苏JS2012株等变异株核苷酸序列同源性为100%；与国内经典株(Ea株、Fa株、SC株等)位于不同小分支；与欧美毒株(Becker株、Kaplan株、Bartha株等)位于不同分支，亲缘关系较远(图9)。与国内经典株相比，PRV分离株与国内变异株仅在G1373A位存在一致的碱基序列替换(对应氨基酸序列发生R458K替换)。

2.7.5gC基因分子特征分析

15株PRV分离株gC基因核苷酸序列同源性在99.79%以上，与国内变异株位于同一分支，且与湖北HNX株、河南HN1201株、天津TJ株、北京BJ-YT株等变异株核苷酸同源性为100%；与国内经典株(Ea株、Fa株等)位于不同分支；与欧美毒株(Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，亲缘关系较远(图10)。与国内经典株相比，PRV分离株与国内变异株存在多处碱基突变、插入，154～210位为碱基序列高变区；30位、581位存在高度一致的碱基替换，即T30G、G581A；175～181位碱基序列由CCCGAGG突变为GGGACGA(氨基酸序列59～61位PEA突变为GTT)；186～206位插入21个连续碱基GGCCGCGGCCTCCACGCCCGC(氨基酸序列63～69位7个连续序列AAASTPA的插入)。

图9 gB基因遗传进化分析Fig.9 Phylogenetic trees for gB gene

2.7.6gD基因分子特征分析

15株PRV分离株gD基因核苷酸序列同源性在99.83%以上，与国内变异株位于同一分支，且与湖北HNX株、河南HN1201株、江苏JS2012株、山东Qihe547株等变异株核苷酸序列同源性为100%；与国内经典株(Ea株、Fa株等)位于不同小分支；与欧美毒株(Bartha株、Becker株、Kaplan株等)位于不同分支，亲缘关系较远(图11)。与国内经典株相比，PRV分离株与国内变异异株均在814～819位存在连续碱基序列AGGCCC的缺失(对应氨基酸序列272～273位2个氨基酸RP的缺失)；在G924C存在高度一致的碱基替换。

图10 gC基因遗传进化分析Fig.10 Phylogenetic trees for gC gene

图11 gD基因遗传进化分析Fig.11 Phylogenetic trees for gD gene

3 讨论

猪伪狂犬病是危害养猪业的一种重要传染病，20世纪90年代以前在我国长时间流行，给养猪业带来巨大的经济损失。自2011年底以来，猪伪狂犬病再度在我国流行，超过20个省市区规模化猪场暴发该病，许多免疫过疫苗的猪场也出现了疫情。黄晓慧等[9]对2012—2015年安徽省224个不同规模猪场的11 855份血清样品进行PRV-gE抗体检测，结果显示该地区猪群PRV感染呈现逐年上升趋势，2014年和2015年猪群感染率分别为11.61%和26.61%；李春芬等[10]对2013—2017年该地区22 130份血清样品进行gE抗体检测，其中2016年和2017年的PRV-gE抗体阳性率分别为14.35%与33.63%；刘华等[11]对安徽地区12个固定监测点猪群进行猪伪狂犬病血清学调查，2017年固定监测点种猪群PRV感染率为19.6%。以上结果表明，猪伪狂犬病在安徽地区广泛流行。目前，我国黑龙江、河南、山东、湖北、福建、广东等多个地区均有PRV分离株遗传变异情况的研究，但尚未见到针对安徽地区PRV临床分离株主要毒力基因分子特征及遗传进化分析的相关报道。

本研究对2016—2018年安徽省临诊病例中疑似PRV感染的病猪进行病原检测，并成功分离鉴定出15株PRV。通过对不同地区猪场分离的15株PRV主要毒力基因比对发现，PRV分离株主要毒力基因核苷酸序列同源性在99.70%以上，但gE、gI、TK、gB、gC和gD基因推导氨基酸序列间存在明显不同，最大差异分别为0.87%、0.55%、0.31%、0.22%、0.62%和0.25%，部分氨基酸位点的突变，可能会导致PRV的毒力及抗原性发生改变，从而使各PRV分离株在致病性和免疫原性上产生明显差异。本研究中，PRV分离株与国内参考毒株的主要毒力基因在核苷酸和氨基酸水平上均具有很高的保守性，其中TK、gI基因推导氨基酸序列未见明显变化，gB、gD基因核苷酸序列同源性均在99.5%以上，且推导氨基酸序列仅少数位点发生变异，与孙佳楠等[12]报道一致。但在高度保守的基础上，gE、gC基因序列仍存在一些差异，且部分差异具有特征性。

gE基因是PRV的主要毒力基因，也是区别疫苗接种和野毒感染的标志基因。gE基因序列的改变可能会对病毒毒力及抗体的有效中和产生一定影响[12-13]。与国内经典株相比，PRV分离株gE基因核苷酸序列在142～144位、1 488～1 490位处均存在3个连续碱基的插入，并导致其氨基酸序列48位、496位各有一个天冬氨酸的插入，而这一特点可作为鉴定PRV变异株的分子特征[13]，从而表明本研究的15株PRV分离株均为变异株。抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，其中可被B细胞表面受体特异性识别并结合的片段称为B细胞表位，gE蛋白表面存在多个B细胞表位[14-15]。与国内经典株相比，PRV分离株在22～84位、480～568位B细胞表位区域的氨基酸(48位、54位、496位)发生了替换及插入，这些氨基酸位点的突变可能导致PRV的抗原性发生改变，进而影响机体免疫应答的产生。

gC糖蛋白是PRV成熟病毒粒子的囊膜蛋白之一，在不同地域的毒株中，gC基因存在2%～3%的差异，这些差异被认为是由病毒应对抗体作用后基因改造的结果[16]。与国内经典株相比，PRV分离株gC基因的特征性变化主要在175～181位碱基的突变及186～206位21个连续碱基的插入。连续碱基的插入与国内变异株具有高度的一致性，亦可作为区分国内经典株与变异株的分子特征[17-18]，进而证实了本研究的15株PRV分离株均为变异株。gC糖蛋白在病毒吸附细胞及传播的过程中起重要作用，也是PRV主要免疫原性蛋白之一，gC基因的改变影响着病毒吸附细胞，刺激机体中和抗体的产生[17]。PRV在传播过程中主要通过gC蛋白表面的硫酸乙酰肝素结合域(HBDs)与细胞表面的硫酸乙酰肝素相结合，参与病毒对宿主细胞的吸附，gC蛋白所诱导的中和抗体可与HBDs结合以阻止病毒对细胞的吸附，从而降低病毒对细胞感染[15，18，19]。gC蛋白共有3个已知的HBDs，HBD1位于76～81位氨基酸处(RRKPPR)，HBD2位于96～100位氨基酸处(HGRKR)，HBD3位于133～141位氨基酸处(RFYRRGRFR)[17，20，21]。与国内外经典株(Bartha株、国内SC株、Ea株、Fa株等)相比，PRV分离株gC蛋白HBD1第5位氨基酸由P→Q，HBD3第3位氨基酸由Y→C。研究显示，HBDs的突变可能会降低疫苗诱导产生的中和抗体对gC蛋白表面硫酸乙酰肝素结合域的结合，进而影响PRV对宿主细胞的黏附作用。gC蛋白作为PRV最主要的保护性抗原之一，能诱导细胞免疫，产生中和抗体，参与补体系统的激活[20-21]。已有报道指出，gC蛋白表面的B细胞表位区域分别位于氨基酸序列65～79位(65-STPPVPPPSVSRRKP-79)、80～94位(80-PRNNNRTRVHGDKAT-94)及85～99位(85-RTRVHGDKATAHGRK-99)[19-20]。与国内外经典株相比，PRV分离株gC蛋白B细胞表位区域的氨基酸序列在69位(V→A)、80位(P→Q)、83位(N→G)、95位(A→S)存在替换。研究表明，一旦PRV gC蛋白的抗原表位发生变化，Bartha-K61疫苗免疫机体所诱导产生的中和抗体无法对PRV变异株进行有效的中和[20-21]。

4 小结

本研究中，安徽省15株PRV分离株均为变异株，gE、gC蛋白抗原表位区域氨基酸的突变可能导致PRV分离株抗原性的改变进而影响传统疫苗的保护效果。国内流行变异株整体上并未表现出明显的区域特征，但PRV分离株gE、gI、TK、gB、gC及gD基因序列与湖北、河南、山东等邻近省份PRV变异株(如湖北HNX株、河南HN1201株、山东Qihe547株等)同源性均为100%，这可能与频繁跨省调运生猪、跨区引种等原因有关，尤其是生猪流动性的增加加剧了运输途中PRV的传播扩散。因此，针对猪伪狂犬病的防控策略，应在重视和加强疫苗免疫的基础上，利用鉴别诊断技术，及时淘汰免疫耐受猪或野毒带毒感染猪，净化猪群，从而有效控制猪伪狂犬病的传播和扩散。