4种胆盐水解酶在发酵乳杆菌AR497中的异源表达

印伯星 石俊康 孔令慧 杨仁琴 艾连中 熊智强

(1. 扬州大学实验农牧场，江苏 扬州 225009；2. 江苏省乳业生物工程技术研究中心，江苏 扬州 225004；3. 扬州市扬大康源乳业有限公司，江苏 扬州 225004；4. 上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；5. 上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

高胆固醇被认为是引起冠心病、高血压及脑中风的重要因素[1]。胆盐水解酶(bile salt hydrolase, BSH)是一种重要的降解胆固醇酶，能够结合胆盐释放游离氨基酸和非结合态胆酸，由于游离胆酸的重吸收利用率低，从而达到降低体内胆固醇的效果[2-3]。目前，从双歧杆菌、乳杆菌和球菌等乳酸菌属中发现的BSH基因具有降胆固醇和耐受胆盐功能[4]。Smet等[5-6]研究表明发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)能降低血清胆固醇的重要原因是能够产生BSH。基于基因组学研究[7-8]发现不同乳酸菌中含有1～4个编码胆盐水解酶的BSH基因，分散在基因组不同位置上，其氨基酸相似度较低，仅为21%～39%。Lambert等[9]通过分别敲除植物乳杆菌WCFS1中的4个BSH同源基因，发现仅BSH1基因和植物乳杆菌的BSH活性密切相关，而其他3种BSH在植物乳杆菌不同菌株之间十分保守；Xiong等[10]从耐胆盐能力强的植物乳杆菌AR113中克隆4个BSH基因，在干酪乳杆菌中异源表达，证明4种BSH均有水解结合甘氨酸胆盐的能力。

发酵乳杆菌作为一种异型发酵乳酸菌，在食品工业中广泛应用。作为益生菌，发酵乳杆菌能减少由致病菌引起的胃肠道疾病发病率、调节免疫系统和降低患膀胱癌的风险[11-12]。由于胃肠道在运输过程中面临胆汁酸压力，因此迫切需要提升发酵乳杆菌的耐受性。尽管发酵乳杆菌中含有一个BSH基因，但发酵乳杆菌对胆盐的胁迫仍比较敏感。课题组前期[13]分离出一株具有优良生物学特性的发酵乳杆菌AR497，能有效改善小鼠肠炎。为提高该菌株耐胆汁和降胆固醇的益生功能，试验拟以AR497为宿主，表达来自植物乳杆菌AR113的4种BSH基因，从胆盐胁迫下菌株的生长状况、致死率和BSH酶活角度分析BSH基因异源表达的作用，为开发耐胆盐和降解胆固醇的乳酸菌基因工程菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

所用菌株与质粒如表1所示。

表1 菌株与质粒Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.1.2 试剂

质粒提取试剂盒：美国Axygen公司；

MRS培养基(牛肉膏5 g/L、酪蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠8.3 g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO40.58 g/L、MnSO40.25 g/L、吐温80 1 mL/L、固体培养基另加琼脂粉15 g/L)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

MRSMC复苏培养基(0.8 mol/L山梨醇、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、MRS培养基)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

分光光度计：DΜ-800型，德国Beckman公司；

电转化杯：2.0 mm型，美国BTX公司；

超微量核算蛋白测定仪：Nanodrop 2000型，赛默飞世尔科技公司；

厌氧培养箱：DG250型，英国Ruskinn公司；

电泳仪：Powerpacbasic型，美国Bio-Rad公司；

电泳槽：170-4486型，美国Bio-Rad公司；

凝胶成像仪：GelDocXR型，美国Bio-Rad公司；

PCR仪：S1000型，美国Bio-Rad公司；

冷冻离心机：3K30型，德国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵乳杆菌AR497感受态制备和重组质粒转化

将-80 ℃冰箱保存的AR497菌株进行活化培养，然后接种至含20 g/L甘氨酸的MRS培养基中培养至OD600 mm为0.3～0.4。收集菌体用10%甘油(体积分数)洗涤两次并重悬分装，-80 ℃保藏，电转化备用。从大肠杆菌中提取pMG36e(空质粒，对照)和含有不同BSH基因的重组质粒pMG-BSH1、pMG-BSH2、pMG-BSH3、pMG-BSH4和pMG-BSH1-3，将这些质粒分别与感受态细胞混匀，电击后加入MRSMC复苏培养基，37 ℃下培养4 h，收集菌体涂布于红霉素抗性平板，37 ℃厌氧培养48 h。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，采用Em-F(5’-CGAAAAACAAGTTAAGGGATGCA-3’)/Em-R(5’-TCAGCACAGTTCATTATCAACCAAA-3’)引物，扩增条件为95 ℃预变性3 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 平板Ca2+沉淀法检测 配制含有0.37 g/L CaCl2的MRS固体培养基平板，加入终浓度5 mmol/L胆盐和100 μg/mL红霉素。取OD600 mm≈1.0的重组菌株菌液10 μL点涂于上述固体培养基平板上，每株菌3个平行。37 ℃厌氧培养48 h，观察培养基底部或菌落周围是否有白色沉淀圈产生。

1.2.3 重组菌株在胆盐胁迫下的生长 将重组菌株培养至OD600 mm≈1.0，3%接种量接种至含有100 μg/mL红霉素和0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL甘氨脱氧胆酸钠盐的MRS培养基中，检测20 h内菌株生长状况[14]。

1.2.4 重组菌株耐胆盐能力的测定 将重组菌株接种至含有100 μg/mL红霉素和0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL甘氨脱氧胆酸钠盐的MRS培养基中，培养12 h进行活菌计数。按式(1)计算致死率。

(1)

式中：

c——致死率，%；

m1——相应胆盐浓度下活菌数；

m2——普通MRS培养下活菌数。

1.2.5 BSH酶活的测定 通过水解结合胆盐释放的氨基酸量来衡量，即酶活力与氨基酸生成量呈正比。采用茚三酮显色法测定氨基酸含量[15-16]。样品超声破碎(200 W 破碎20 min，工作5 s，间隔10 s)后加入溶菌酶，使细胞壁裂解完全，参照文献[17]的方法测定上清液BSH活力。BSH酶活定义为每毫升菌体裂解上清液水解胆盐生成1 mmol氨基酸为一个活力单位。

1.3 数据分析

采用 Origin 8.0和GraphPad 5.0软件进行统计分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 发酵乳杆菌BSH基因工程菌的鉴定

转化子菌落PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图1)表明，含有重组质粒的菌株都有734 bp的特异性条带，且与预期大小一致，而不含重组质粒的AR497没有条带，说明重组质粒均已成功转化至AR497中。

M. 2 000 Marker 1. 阴性对照 2. AR497/pMG36e 3. AR497/pMG-BSH1 4. AR497/pMG-BSH2 5. AR497/pMG-BSH3 6. AR497/pMG-BSH4 7. AR497/pMG-BSH1-3图1 转化子菌落PCR电泳Figure 1 Electrophoretogram of colony PCR

2.2 平板Ca2+沉淀法检测发酵乳杆菌BSH基因工程菌

由图2可知，除表达BSH2的重组菌外，其他工程菌均无法在添加5 mmol/L甘氨脱氧胆酸钠盐的MRS培养基上生长；表达BSH2的重组菌周围产生不透明白色沉淀圈，说明该重组菌株具有降解甘氨脱氧胆酸钠盐的能力[10]。空载体菌株与重组菌株都可以在含有5 mmol/L牛磺鹅脱氧胆酸钠盐的MRS固体培养基上生长，说明AR497具有良好的牛磺鹅脱氧胆酸钠盐耐受能力。在含有5 mmol/L牛磺鹅脱氧胆酸钠盐和甘氨脱氧胆酸钠盐的MRS固体培养基上，除空载体与BSH4表达菌株生长受到完全抑制外，其他菌株在该平板上均有生长，但表达BSH2或同时表达BSH1和BSH3菌株其耐受性明显优于表达BSH1或BSH3菌株。此外，含牛磺鹅脱氧胆酸钠盐的平板无明显白色沉淀圈形成，说明其BSH酶活偏低或不具有水解牛磺鹅脱氧胆酸钠盐的能力。

图2 Ca2+沉淀法检测重组菌的耐胆盐能力Figure 2 Bilesalt resistance of recombinant bacteria bycalcium ion precipitation method

2.3 发酵乳杆菌BSH基因工程菌在胆盐胁迫下的生长

由图3可知，在没有胆盐压力下，与对照菌株AR479/pMG36e相比，表达BSH基因重组菌株可显著提高发酵乳杆菌AR497的胆盐耐受性，BSH2和BSH4基因的表达对菌株生长具有一定的抑制作用，BSH1和BSH3基因的表达对菌株生长有促进作用。重组菌株在0.5 mg/mL胆盐的MRS培养基中培养时，与不加胆盐相比，重组菌株生长受到一定程度的抑制。重组菌株的生长随甘氨脱氧胆酸钠盐浓度的提高受到明显抑制，但BSH2基因的表达对菌株表现出优良的耐胆盐特性；当胆盐浓度提高到1.5 mg/mL时，在液体MRS培养基中，除表达BSH2重组菌株外，其他重组菌株均无法生长。综上，异源表达植物乳杆菌来源的BSH能够提高发酵乳杆菌的耐胆盐能力。

图3 重组菌株在不同甘氨脱氧胆酸钠盐浓度下的生长曲线Figure 3 Growth curve of recombinant strains under different glycodeoxycholic acid sodium salt

2.4 发酵乳杆菌BSH基因工程菌的耐胆盐能力

由图4可知，随着甘氨脱氧胆酸钠盐浓度的增加，表达BSH2重组菌活菌总数并未减少，表明BSH2基因的表达可提高AR479的耐受胆盐能力；表达BSH1、BSH3、BSH4及同时表达BSH1和BSH3基因的重组菌株致死率逐渐升高，BSH基因对发酵乳杆菌提高胆盐耐受效果依次为BSH2>BSH1和BSH3>BSH1>BSH3>BSH4，其中过表达BSH4基因与对照相比，效果不显著(P>0.05)。

2.5 发酵乳杆菌BSH基因工程菌BSH酶活

由图5可知，表达BSH2基因重组菌株酶活最高，达57.74 U/mL，为对照菌株酶活的2.88倍，推测BSH2基因可能在水解结合型甘氨类胆盐为非结合型胆盐过程中效果更强，与前述试验结果相符；而表达BSH1和BSH3、BSH1、BSH3及BSH4基因重组菌株的酶活依次降低。Ren等[18-19]在大肠杆菌中表达植物乳杆菌ST-III的4种BSH基因，其酶活数据与试验结果类似。Lambert等[9]在乳酸乳球菌中表达植物乳杆菌WCSF1的4种BSH基因，其中BSH1基因的活性最高，与试验结果不同，可能与宿主或酶活测定方法(如反应条件和胆盐底物)不同有关[20]。

图4 重组菌株的胆盐致死率Figure 4 Lethality of recombinant strains bybile salt

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

3 结论

将具有强耐胆盐能力的植物乳杆菌AR113中4种BSH同功酶基因通过基因工程技术，在发酵乳杆菌AR497中异源表达。通过测定不同BSH基因表达菌株的生长、胆盐耐受性和酶活，发现重组菌株均能在0.5 mg/mL 甘氨脱氧胆酸钠盐的胁迫下生长，仅AR497/pMG-BSH2能够将结合态甘氨脱氧胆酸钠盐为转化为游离态；BSH2重组菌株的BSH酶活最高，达57.74 U/mL，表明BSH2可能具有较其他3种BSH更高的水解甘氨脱氧胆酸钠盐的能力。后续可进一步研究4种BSH同功酶的动力学和蛋白结构特征，解析BSH2对甘氨脱氧胆酸钠盐的水解机制。