不同生长因子对植物乳杆菌固体发酵的影响

邴狄祥 张琳 郭世堂 刘利利

摘      要：根据不同生长因子的促生长效果，研究了沸石粉、麦饭石、番茄汁、菊粉对提高植物乳杆菌固体发酵终点益生菌数量的影响。试验结果说明：在复合生长因子番茄汁和菊粉添加量分别为1%、0.5%时，终点益生菌数量最高为137×10⁸ cfu/g，是对照组的6.5倍，是分别单独添加时的2倍左右，实现了植物乳杆菌固体发酵的高密度培养，为下一步的低温烘干制取高活性菌粉打下了基础。

关  键  词：生长因子;沸石粉;番茄汁;菊粉;高活性

中图分类号：TQ921.1        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）01-0212-04

Effect of Different Growth Factors on Solid Fermentation

of Lactobacillus Plantarum

BING Di-xiang， ZHANG Lin， GUO Shi-tang， LIU Li-li

（COFCO Biotechnology Co.， Ltd.， Anhui Bangbu 233010， China）

Abstract： According to the growth promoting effect of different growth factors， the effect of zeolite powder， medical stone， tomato juice and inulin on increasing the number of terminal probiotics of Lactobacillus plantarum in solid fermentation was studied. The results showed that，when the dosages of compound growth factor tomato juice and inulin were 1% and 0.5%， respectively， the maximum number of terminal probiotics was 137×10⁸ cfu/g， which was 6.5 times as much as that of control group， and about 2 times as much as that of single addition. The high-density culture of Lactobacillus plantarum solid fermentation was realized， which laid a solid foundation for next low-temperature drying to produce high-activity bacterial powder.

Key words： Growth factor; Zeolite; Tomato juice; Inulin; High activity

植物乳桿菌是一类革兰氏阳性乳杆菌，在自然界中广泛存在，厌氧或兼性厌氧，菌种为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌（图1）。

植物乳杆菌可以产生细菌素、有机酸、双乙酞、过氧化氢等多种天然抑菌物质，具有平衡肠道内菌群，提高免疫力，促进营养吸收等功能^[1]。我国农业农村部第105号公布的允许使用的饲料添加剂品种目录中，饲料级微生物添加剂有12种，植物乳杆菌是其中一种。在饲料中添加植物乳杆菌菌剂，其能通过竞争性抑制作用在胃肠道内占位、定植，抑制致病菌对胃肠道侵害，不仅可以改善动物肠道生态，还可以用于饲料的防腐，是目前公认的具有潜在开发价值的天然生物性防腐剂^[2，3]。

本文试图从不同生长因子特有的促生长功能出发，以筛选出最佳生长因子及其最适添加量。各促生长因子主要功能如下：

沸石粉：硅铝酸盐矿物，可以很好地平衡pH值，同时含有离子状态的常量元素和大部分微量元素，易于吸收。

麦饭石：麦饭石是一种高效无毒的药物矿石，含有多种对生物生长发育有益的常量元素、微量元素以及被称作动物生长调节剂的稀土元素和微量氨基酸^[4]。

番茄汁：番茄含有多种活性物质， 如维生素C、黄酮、多酚、番茄红素、有机酸、氨基酸、矿物质、类胡萝卜素和维生素等^[5]。

菊粉：水溶性膳食纤维，可刺激微生物代谢产生短链脂肪酸，对益生菌的生长起到一定的促进作用^[6]。

1  实验部分

1.1  材料

1.1.1  菌种与培养基

菌种：中粮生物科技股份有限公司保存菌种。

MRS培养基：蛋白胨10.0 g，吐温80 1.0 mL，牛肉提取物10.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，酵母提取物5.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，MnSO₄·H₂O 0.05 g，K₂PO₄ 2.0 g，配成1 000 mL的溶液，用NaOH调pH值至6.5，121 ℃，灭菌20 min。

MRS固体培养基： 蛋白胨10.0 g，吐温80 1.0 mL，牛肉提取物10.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖5.0，乙酸钠5.0 g， 酵母提取物5.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，MnSO₄·H₂O 0.05 g，K₂PO₄ 2.0 g，琼脂16 g，配成1 000 mL的溶液，用NaOH调pH值至6.5，121 ℃，灭菌20 min。

1.1.2  仪器与设备

AB204-S电子分析天平、YX600W臥式全自动高压灭菌锅、海德双人单面超净工作台、722型分光光度计、LRH-150电热恒温生化培养箱、XH-C旋涡混合器、Seveneasy台式pH计、Innova43往复式摇瓶柜。

1.2  方法

1.2.1  液体种子培养

将保存在超低温冰箱中的植物乳杆菌提前0.5 h自然解冻活化，之后按照4%接种量接种于121 ℃、20 min灭菌，冷却至室温的MRS培养基中，37 ℃静止培养，测种子液pH、OD值和13 h后益生菌数量^[7]。

（1）菌液OD₆₀₀值的测定

将培养好的菌液，转速为6 000 r/min（4 ℃），离心10 min，收集菌体，生理盐水洗涤2次，悬浮于等体积生理盐水，取样稀释26倍后，于波长600 nm处测定OD值。

（2）益生菌数量的测定

采用稀释平板计数法，取1 mL菌液以10倍依次递增稀释至适宜稀释度，选择3个合适稀释度，各取1 mL稀释液于空的无菌培养皿中，各倾注15 mL已溶化并冷却至45 ℃左右的培养基，立即放在桌上混匀，每个稀释度做3个培养皿，凝固后倒置于37 ℃培养24h取出记录菌落数。

具体操作严格按照GB4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》执行。

1.2.2  固体发酵基础培养基配制

将麸皮、玉米芯粉、稻壳粉分别粉碎过60目筛后，按麸皮∶玉米芯粉∶稻壳粉=1∶2∶2混合均匀。玉米浆、葡萄糖、大豆蛋白胨及磷酸氢二钾加水溶解后与上述固体原料再次混合均匀，加水至45%水分， 用NaOH调pH值至6.5后得到基础培养基。

1.2.3  促生长因子的筛选

采用单因素多水平试验设计，将沸石粉、麦饭石、番茄汁、菊粉分别按0.5%、1.5%的添加量加入基础培养基中得到固体发酵培养基，121 ℃、20 min灭菌，冷却至室温，接种10%的液体种子，同时做空白对照试验，空白对照组不加促生长因子。以相同周期的活菌数作为评价指标，筛选出具有明显增殖效果的生长因子（图2）^[8]。

1.2.4  复合生长因子添加量的确定

将筛选得到的两种增殖效果最好的生长因子按不同配比加入基础培养基中，进行固体发酵试验，运用方差分析，以相同周期的活菌数作为评价指标，筛选得到复合促生长因子的最适添加量。

2  结果与分析

2.1  种子培养周期确定

从图3可以看出，液体种子培养16～17 h时pH降至4.0以下，之后缓慢降低;OD值达到最大值后基本保持稳定状态，可认为菌体生长进入稳定期。

由图4益生菌数量变化趋势可以看出，液体种子培养至16～17 h时，益生菌数量在45×10⁸ cfu/g左右且趋于稳定，结合图1可认为此时种子到达稳定期，下步试验可选取对数生长后期或稳定期前期的液体种子接种发酵，即液体种子培养14～17 h。

2.2  促生长因子的初步筛选

从表1可以看出，不同促生长因子对固体发酵的影响存在着周期上的明显差异。

具体促生长表现为：

沸石粉和麦饭石在80 h全发酵周期内对益生菌增殖的促进作用表现平稳，其中沸石粉添加组略好于麦饭石添加组，0.5%、1.5%的添加比例对发酵益生菌数量增殖影响不显著，80 h时益生菌数量最高为对照组的1.7倍;

番茄汁添加组发酵前期益生菌数量较对照组增殖明显，48～64 h后趋于稳定，80 h时益生菌数量最高为对照组的3.4倍;

菊粉添加组发酵前期益生菌数量较对照组无明显提高，48 h后开始增殖较为迅速，至80 h时仍在快速增殖，最高为对照组的3.1倍。

利用Minitab进行单因素方差分析发现，沸石粉、麦饭石与空白组对照相比，P值分别为0.212和0.073，均大于0.05，故认为两者对终点益生菌数量影响不显著。而番茄汁和菊粉的P值分别为0.017和0.039，小于0.05，可认为番茄汁和菊粉相对空白对照组对终点益生菌数量影响都极为显著。鉴于此，下步复合促生长因子试验时拟采用番茄粉和菊粉的组合，同时将发酵周期延长至96 h（表2、图5-6）。

2.3  复合促生长因子添加量的确定

从表3可以看出，96 h时益生菌数量最高可达166×10⁸ cfu/g，基本同80 h时的益生菌数量持平，故可认为固体发酵80 h时已达发酵终点，此时益生菌数量最高为165×10⁸ cfu/g，可结束发酵，经低温烘干、粉碎后制取植物乳杆菌菌粉。

利用Minitab进行方差分析发现，不同添加量情况下番茄粉和菊粉P值分别为0.001和0.011，均小于0.05，作为促生长因子两者对终点益生菌数量影响显著，这同单因子方差分析结果保持一致。而两者交互作用时的P值为0.776，大于0.05，可认为两者交互作用不存在（表4）。

由主效應图（图7），进一步分析可得知，番茄汁和菊粉添加量均为1.5%时，为该组合效应的最佳水准。但由于两者交互作用不显著，此时不设定最佳水准。最终选取番茄粉、菊粉的添加量分别为1.0%、0.5%时，在生产成本不明显增加的前提下，又可获得较高的终点益生菌数量，80 h时益生菌数量可达137×10⁸ cfu/g，为对照组的6.5倍。

3  结论

通过不同促生长因子对植物乳杆菌发酵的影响，得出试验使用的4种促生长因子对固体发酵都有不同程度的增殖作用，并进一步采用对固体发酵增殖效果最好的番茄汁和菊粉作为复合促生长因子，在综合考虑生产成本和终点益生菌数量的情况下，在基础培养基中添加1.0%番茄粉、0.5%菊粉时，终点益生菌数量最高可达到137×10⁸cfu/g，是对照组的6.5倍，是分别单独添加时的2倍左右，实现了植物乳杆菌固体发酵的高密度培养，为下一步的低温烘干制取高活性菌粉打下了坚实的基础。

参考文献：

[1]李疆，周海珍，李开雄.SAS软件优化植物乳杆菌增殖培养基的研究[J].食品研究与开发，2007，28（6）：416-420

[2]王国仓，李增辉，范秀兰.微生物在青贮饲料中的作用[J].内蒙古畜牧科学，2003（3）：55-56.

[3]山丽杰，田洪涛，贾英民，等.浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个

技术关键问题的探讨[J].中国乳品工业，2002，30（5）：5-9.

[4]王银叶，马育莲，史艳娇.活性麦饭石孔结构的探讨及应用[J]. 天津化工，2003，7-9.

[5]Prieto MA， Vázquez JA. In vitro determination of the lipophilic andhydrophilic antioxidant capacity of unroasted coffee bean extracts andtheir synergistic and antagonistic effects [J].Food Res Int， 2014， （62） ：1183–1196.

[6]杨吉雨. 植物源添加剂对益生菌生长的影响和益生菌微生态制剂的开发[D]. 长春： 吉林大学， 2015.

[7]隋春光，梁金钟，王风青.植物乳杆菌LP-S2高密度培养的研究 [J]. 粮食与饲料工业， 2016，49-53.

[8]张春宇，范翠翠，张晓蕊，徐长隆.促生长因子对嗜酸乳杆菌H0606培养的影响[J]. 食品安全导刊， 2018，50.