甘草次酸抑制骨肉瘤细胞MG63增殖的NF-κB信号通路机制*

董 嵩， 刘培敏， 杜向阳， 李凤岩， 曹 营， 林大勇， 白 剑

((1. 朝阳市第二医院， 辽宁 朝阳， 122000； 2. 辽宁中医药大学， 沈阳 110847)

骨肉瘤是青少年多发的骨科恶性肿瘤之一，其容易发生早期的转移，病情进展迅速，愈后不良[1]。由于骨肉瘤增长迅速，因此需要对骨肉瘤进行有效的以化疗为主，在条件成熟后进行手术切除。但是化疗有着极大的副作用，临床急切需要寻找一种副作用低、容易获取、疗效好的新型药物用于骨肉瘤的辅助治疗。

核转录因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)蛋白是一个表达于多种细胞中的多效性转录因子家族，正常情况下NF-κB处于非活化的状态，但在炎症、肿瘤和免疫功能改变的情况下NF-κB基因发生活化并导致其所编码的蛋白明显升高。有研究表明，骨肉瘤的增殖与NF-κB蛋白的表达呈正相关，在骨肉瘤的转移、侵袭过程中NF-κB蛋白也起到促进作用[2]。甘草具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛、清热解毒、调和诸药等功效。甘草酸是发挥其药理活性的重要有效成分之一，甘草酸进入体内后可以水解为甘草次酸和甘草黄酮等活性成分，其中甘草次酸具有的抑制肿瘤细胞生长的药理学作用[3]。本研究在此基础上，通过体外细胞培养的方法，观察甘草次酸对骨肉瘤细胞MG63增殖的抑制作用，并分析可能的机制，

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

甘草次酸购买于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(产品标号：S0988，HPLC ≥98%)；甘草次酸和甲基四氮唑蓝(TOX1-1KT)和白藜芦醇(R5010)购买于SIGMA-ALDRICH中国有限公司；骨肉瘤细胞MG63购买于北京鼎国昌盛生物科技有限公司；DMEM培养液购买于美国Gene公司；胰酶和Hyclone小牛血清购买美国Thermo scientific公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购买于美国BD公司；NF-κB抗体买于美国Santa Cruze生物技术公司；测其余分析纯试剂购买于国药集团北京分公司。低速离心机购(型号：H1650)买于湖南湘仪仪器装备有限公司；流式细胞仪(型号：FACSCalibur)购买于美国BD公司；CO2培养箱(型号：Form 311)购买于美国Thermo公司；酶标仪(型号：SpectraMax 190)和垂直系列电泳槽(型号：165-8001)购买于美国Bio-Rad公司。

1.2 实验分组设计与处理方法[4]

本实验采用骨肉瘤MG63细胞做为研究对象，共分5组。空白组、甘草次酸组(50 μmol/L， 100 μmol/L，200 μmol/L)、阳性对照组。当细胞进入生长平台期后使用 0.1%的胰酶消化并按1×106cells/ml的密度接种于96孔板中进行MTT试验。将骨肉瘤细胞MG63用PBS冲洗2次后，加入 1.25%的胰酶消化3 min后，加入含有10%血清的DMEM培养基，将细胞按照1×106cells/ml的密度接种于96孔板中进行MTT试验。将MG63细胞按照1×108cells/ml的密度接种于6孔板中进行流式细胞检测和蛋白质印迹检测，待细胞贴壁后继续培养24 h，直至细胞的融合度接近90%。弃去上清，6孔板中加入不含血清的DMEM培养基，阳性对照组中加入白藜芦醇40 μmol/L，实验组中加入浓度分别为50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的甘草次酸，空白组为不含有甘草次酸的DMEM培养基，在5%的二氧化碳培养箱中孵育24 h和48 h。

1.3 MTT方法检测各组细胞的增值率

将接种于96孔板的用于MTT试验的MG63细胞取出，弃去上清液，用PBS冲洗2次，在每个孔中加入50 μl的含有MTT浓度为5 g/L的PBS溶液，在室温静置4 h，弃去上清液，每孔中加入DMSO 150 μl，在混匀仪上振动混匀30 min，使用550全自动酶标仪在570 nm下检测光密度(OD)度值。计算细胞增值率(%)=各孔OD值/对照组OD值均数×100%。

1.4 Annexin V / PI双标记流式细胞术检测骨肉瘤细胞MG63的凋亡

将在6孔板内培养各组骨肉瘤细胞MG63消化后 1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS清洗2次，加入500 μl的Binding buffer重悬细胞制备单细胞悬液并调整浓度为1×106cells/ml，取200 μl细胞悬液，加入Annexin V-FITC流式抗体5 μl混匀，再加入5 μl Propidium Iodide，混匀，避光室温孵育20 min后流式细胞仪检测细胞凋亡的比例。

1.5 蛋白质印迹法检测检NF-kB蛋白的表达

使用蛋白裂解液将在6孔板内培养48 h的各组骨肉瘤细胞MG63裂解，将裂解产物收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min后通过高速离心机12 000 r/min离心1 min。BCA法进行蛋白浓度的测定，向SDS-PAGE凝胶中加入样本，电泳分离后电转移至PVDF膜。加入NF-κB (1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗体，4℃孵育过夜后，加入二抗再37℃孵育30 min。通过凝胶成像分析系统，并通过各条带的吸光度值计算蛋白的相对表达量。结果采用各组中NF-κB灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 甘草次酸对骨肉瘤细胞MG63 增殖率的影响

采用MTT的方法计算细胞的增值率，在不同浓度的甘草次酸中孵育24 h后，骨肉瘤细胞MG63增值率与空白组相比有显著性差异(P<0.05)；在不同浓度的甘草次酸中孵育48 h后，骨肉瘤细胞MG63增值率与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05，表1)。甘草次酸200 μmol/L组其骨肉瘤细胞MG63的增值率最低，与阳性对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

Tab. 1 Comparison of the proliferation rate of cells in each group after incubation with different concentrations ofglycyrrhetinic acid for 24h and 48h(%, n=6)

2.2 甘草次酸对骨肉瘤细胞MG63凋亡率的影响

流式细胞仪对凋亡细胞的比例进行检测，结果显示在经过甘草次酸孵育24 h后，在50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸组中凋亡细胞比例与空白组相比有显著性差异(P<0.05)；结果显示在经过甘草次酸孵育48 h后，在50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸组中凋亡细胞比例与对照组相比有显著性差异 (P<0.05，表2)。

Tab. 2 The proportion of apoptosis of osteosarcoma cells MG63 detecting byAnnexin V / PI double labeling flow cytometry ( %, n=6)

2.3 甘草次酸对对骨肉瘤细胞MG63的NF-κB蛋白表达的影响

采用蛋白印迹的方法检测各组细胞NF-κB蛋白的表达，结果显示甘草次酸孵育24 h和48 h后，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸组中的NF-κB蛋白的相对表达量分别为与空白对照组相比有显著差异(P<0.05，表3)

Tab. 3 Relative expression levels of NF-κB protein in each group after incubation with different concentrations ofglycyrrhetinic acid for 48 h n=6)

3 讨论

骨肉瘤是一种恶性程度较高，容易转移的恶性肿瘤，且对化疗的反应较差。甘草是一种具有补益功能的中草药。在神农《神农本草经》中有记载“甘草，主五脏六腑寒邪气，坚筋骨，长肌肉，倍气力，金疮肿，解毒。”甘草重要活性成分之一甘草次酸，具有抗炎、抗病毒、抑菌、抗肾损伤、抗溃疡、降血糖、免疫调节、抗氧化和肝细胞保护作用等药理学活性[5]。而近年来的国内外的诸多研究证明，甘草次酸可以在体外抑制血液肿瘤、胃癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌和食管癌等多种类型的肿瘤细胞的增殖[6-7]。Pirzadeh 等[8]采用流式细胞术观察到甘草次酸能以剂量依赖的方式上调人白血病细胞 HL-60表面CD95 和 CD178 的表达，从而引起细胞凋亡。Sharma等[9]研究发现甘草次酸对乳腺癌 MCF-7 细胞的生长产生抑制作用。李凤岩等研究表明，甘草次酸可通过抑制 AKT 蛋白的表达促进甲状腺癌细胞 SW579 凋亡，通过有效的抑制 AKT 信号就能够促进肿瘤 细胞的凋亡，对于肿瘤的辅助治疗有着积极的作用[10]。 目前国内对甘草次酸对骨肉瘤细胞的影响的研究尚未见，本文通过体外培养的方法，研究甘草次数对骨肉瘤细胞MG63的影响，并探究其可能机制，为临床治疗骨肉瘤提供新的视野。本研究结果显示，在不同浓度的甘草次酸中孵育24 h和48 h后，骨肉瘤细胞MG63增值率和凋亡率与空白组相比有显著性差异,均P<0.05，说明甘草次酸对骨肉瘤的增殖具有抑制作用。

NF-κB是多效性转录因子家族，表达于多种细胞，正常情况下NF-κB处于非活化的状态。目前研究表明NF-κB的活化与机体防御反应、组织损伤与应激、细胞的分化和调亡以及肿瘤生长呈正相关，在乳腺肿瘤、甲状腺肿瘤、骨肿瘤中均发现NF-κB表达明显升高，如果能有有效抑制NF-κB信号通路就能够减缓肿瘤的生长，为临床治疗提供思路[11]。王玉峰[12]等研究表明NF-κB的抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)能够诱导骨肉瘤细胞的凋亡，其可能机制为PDTC能抑制NF-κB的信号通路，下调Livin和上调Caspase-9有关。本研究结果表明骨肉瘤细胞MG63经过甘草次酸孵育48 h后，不同浓度组的NF-κB蛋白的相对表达量分别降低，这表明甘草次酸可能通过影响NF-κB信号通实现其刺激细胞凋亡的作用，但是其具体机制仍需要进一步研究。

综上所述，甘草次酸能够抑制骨肉瘤细胞MG63的增殖，其可能的影响机制为NF-κB信号通路，但是仍需进一步的研究和证实。甘草的来源广泛，毒副作用低，价格低廉，具有较好的临床应用前景。