格列齐特对糖尿病大鼠心肌的保护作用及其机制*

潘文强， 王书凡， 丁伯平， 黄帧桧

((皖南医学院药理学教研室及中药药理国家三级实验室， 安徽 芜湖 241002)

近年来糖尿病发病率逐年上升，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病引起，与冠心病及微血管疾病发病机制不同的特异性心肌损害疾病[1]。DCM的发病机制较为复杂，目前认为氧化应激、炎症、心肌纤维化、细胞凋亡等参与该病的发生，主要表现为心脏舒缩功能障碍，最终发展为心力衰竭，与正常人相比，DCM患者发生心脏疾病的概率明显增加，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一[2-5]。

格列齐特(Glic)属于第二代磺酰脲类降糖药，临床上广泛用于治疗II型糖尿病，Glic可以促进胰岛素分泌降低血糖，同时能够降低血小板粘附力，改善血小板聚集，由于其独特的氮杂环结构，Glic可以清除氧自由基，因此Glic在降糖的同时，对糖尿病的并发症也有一定的改善作用[6-7]。格列本脲(Glib)同属于磺酰脲类降糖药，本品通过刺激胰岛β细胞释放胰岛素，其作用强度较强，因此所用剂量明显减少。盐酸法舒地尔(Fas)属于Rho激酶抑制物，可以抑制高血压和改善心肌肥厚[8]。目前关于Glic对糖尿病心肌病的研究较少，本实验通过建立糖尿病大鼠模型，分别给予Glic、Glib和Fas，通过与后两者的对比，探讨Glic对糖尿病大鼠心肌损伤的影响并探讨其机制，为临床治疗糖尿病心肌病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只雄性SD大鼠，体质量(220±20)g，许可证号：SCXK(浙)2014-0001，购于南京青龙山繁殖场，温度(23±2)℃，动物自由饮水和进食。

1.2 实验仪器

EL-800多功能酶标仪(BIO-TEK，USA)；-80℃冰箱(Thermo Fisher科技公司)；Mini PROTEAN转模系统(美国BIO-RAD公司)；BX-41型奥林巴斯显微镜(OLYMPUS公司)；22R高速冷冻离心机(Beckman Coulter)

1.3 药物与试剂

格列齐特(施维雅制药有限公司)；盐酸法舒地尔注射液(天津红日药业股份有限公司)；STZ(源叶生物有限公司)；血糖仪和血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司)；糖化血红蛋白(HbA1c)测定试剂盒、总胆固醇(TC)测定试剂盒(南京建成有限公司)；TUNEL试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；RhoA、ROCK1、eNOS抗体(Abcam公司)；BCL-2抗体(Affinity公司)；Bax抗体(北京博奥森生物技术有限公司)

1.4 模型的建立与给药

雄性SD大鼠60只，适应性喂养7 d，随机选10只喂养普通饲料作为正常对照组(NC组)，其余50只喂养高糖高脂饲料4周后，禁食不禁水12 h，使用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制1% STZ溶液，腹腔注射(45 mg/kg，pH 4.4)诱导糖尿病。注射72 h后，随机抽取测定FBG≥16.7 mmol/L作为糖尿病模型建立成功[9]。造模成功的38只糖尿病大鼠随机分为模型组(MC组，n=9)、格列齐特组(Glic组，80 mg/kg，n=10)、格列本脲组(Glib组，2.5 mg/kg，n=10)、法舒地尔组(Fas组，10 mg/kg，n=9)。Glic组和Glib组采取灌胃，Fas组进行腹腔注射，每天一次，NC组和MC组每天灌胃同体积的蒸馏水，连续8周，每周测定一次空腹血糖和体质量，按体重调整给药物剂量。

1.5 状态的观察和指标检测

观察各组大鼠皮毛、状态、精神情况等，每周测定一次体质量和血糖。实验结束时，使用10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清并按照试剂盒的要求测定血清HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C；按照试剂盒要求测定MDA含量和SOD活性。摘取心脏生理盐水冲洗干净后，测定心脏重量，按照公式计算心脏质量指数(HWI)，HWI=心脏质量/体质量(mg/g)。

1.6 心肌组织的病理学观察

待大鼠麻醉后腹主动脉取血，快速取出心脏并用生理盐水冲洗，取心脏的三分之一心尖处置于10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水后石蜡包埋切片，置于伊红水溶液中进行染色3 min之后，再次脱水封片，显微镜下观察心肌组织病理学的变化。

1.7 心肌纤维化的检测

腹主动脉取血后，摘取心脏生理盐水冲洗，切取心尖组织以10%甲醛溶液固定，梯度脱水后石蜡包埋后切片，然后进行梯度乙醇脱蜡，按试剂盒要求进行Masson染色。心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)的计算，每组随机选用5个视野，使用分析软件Image-Pro Plus 6.0进行计算，CVF=胶原面积/视野总面积，取平均值。

1.8 心肌细胞TUNEL凋亡检测

取心脏的三分之一心尖处置于10%甲醛溶液固定，常规石蜡切片5 μm，取石蜡切片按照TUNEL凋亡试剂盒的要求加入TUNEL反应液，TUNEL阳性细胞核内可见棕黄色颗粒，阴性细胞呈现淡蓝色。在光学显微镜下拍照，每个切片至少观察20个不重叠区域，每组随机选取5个不同视野，计算每个视野凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%，取平均数。

1.9 Western blot检测心肌RhoA、ROCK1、eNOS、Bcl-2和Bax蛋白表达

按步骤测定ras同源家族成员A(Ras homolog gene family member A，RhoA)、Rho相关蛋白激酶1(Rho associated coiled coil forming protein kinase l，ROCK1)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial Nitric-Oxide Synthase，eNOS)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和BCL2-Associated X(BCL2-Associated X，Bax)的蛋白表达。取心脏组织45 mg，RIPA裂解液(含磷酸酶和蛋白酶抑制剂)裂解组织，采用BCA蛋白测定法检测蛋白浓度，在电泳凝胶中电泳后使用PVDF膜进行转膜。转膜完成后将膜置于5%脱脂牛奶中孵育2 h，再次加入RhoA、ROCK1、eNOS、Bcl-2、Bax和GADPH抗体在4 ℃下孵育8 h以上。使用辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h，在凝胶图像分析仪下加入发光液来分析目的条带的光密度，采用image-pro PLUS处理软件分析图像。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠的一般状态观察及血糖和体质量变化

NC组大鼠皮毛光亮，状态良好，血糖稳定，体质量逐步上升。MC组大鼠毛色枯黄，精神萎靡，血糖上升，体质量下降明显。与MC组比，Glic组上述情况有明显改善，血糖降低，体重增加(P<0.01，表1，表2)，Glib组血糖降低，体重有所增加，Fas组血糖及体重无明显差别。与Glic组相比，Glib组和Fas组体重下降(P<0.01，表1，表2)。

Tab. 1 Changes of fasting blood glucose (FBG) in each group (mmol/L,

Tab. 2 Changes in body mass(BM) in each group (g,

2.2 各组大鼠的HW及HWI的变化

与NC组相比，MC组心脏质量指数增大(P< 0.01，表3)；与MC组相比，Glic组和Glib组心脏质量指数降低，Fas组无明显改善；与Glic组相比，Glib组及Fas组心脏质量指数增大(P<0.01或P<0.05，表3)，提示Glic和Glib可以改善糖尿病大鼠的心脏肥大，而Glic组改善更加明显(P<0.05，表3)。

Tab. 3 Changes of cardiac weight index in each

2.3 各组大鼠的血脂变化

与NC组相比，MC组大鼠HbA1c、TC、TG、LDL-C水平均有显著升高，HDL-C水平降低(P<0.01，表4)；与MC组相比，Glic组HbA1c、TC、TG、LDL-C水平均有明显下降，HDL-C水平也有所提升(P<0.01，表4)，Glib组HbA1c、TC、TG、LDL-C也有改善(P<0.01或P<0.05，表4)，Fas组无明显变化。Glic和Glib可以调控糖脂代谢，改善血脂，而Fas不能。

Tab. 4 Changes of blood lipid in rats of each

2.4 各组大鼠血清中SOD活性及MDA含量

与NC组相比，MC组大鼠血清中SOD活性明显降低，MDA水平增加；与MC组相比，Glic组SOD活性提高，氧化应激损伤物MDA含量明显减少，Fas组和Glib组SOD活力也有所提高，MDA含量减少(P<0.01或P<0.05，表5)；与Glic组相比，Glib组及Fas组SOD活性下降，MDA含量增加(P<0.01，表5)，提示各治疗组中Glic组改善氧化应激最为明显。

Tab. 5 SOD activity and MDA content in serum of rats in each

2.5 HE染色观察大鼠心肌组织形态学变化

NC组大鼠心肌细胞排列整齐致密，着色均匀且细胞结构清晰完整，MC组大鼠心肌细胞排列紊乱，可见大量心肌细胞肌浆溶解，MC组心肌细胞发生了明显损伤。与MC组相比，Glic组病变较轻，可见轻度的肌浆溶解，Fas组损伤有轻微改善，而Glib组未见明显改变(图1，见彩图页Ⅱ)。

2.6 Masson染色与TUNEL染色

Masson染色结果显示，NC组大鼠心肌组织中细胞排列整齐且细胞间质胶原纤维分布很少，染色面积少且染色较淡，MC组大鼠的心肌组织细胞分布杂乱且细胞间基质较多，被染色的面积明显增大。与MC组相比，Glic组和Fas组心脏组织细胞间隙减小且被染色的组织胶原也明显下降(P<0.01，图2，表6)，Glib组纤维化有轻微改善(P<0.05，图2，表6)。Glic组与Glib组相比，前者改善心肌纤维化更加明显(P<0.01)；Glic组与Fas组相比，两组之间无明显差异。提示Glic和Fas可以明显改善纤维化，而Glib有轻微改善作用(图2，见彩图页Ⅱ)。

TUNEL染色结果显示，正常细胞核呈淡蓝色，凋亡的细胞核呈棕褐色颗粒样(TUNEL阳性细胞)。NC组大鼠心肌细胞整齐且细胞核完整清晰，极少见阳性细胞，MC组中心肌细胞排列杂乱且细胞核呈褐色的阳性细胞明显增加，淡蓝色正常细胞显著减少，可见凋亡细胞数量明显上升(P<0.01，图3，表6)。与MC组相比：Glic组和Fas组阳性细胞数量明显减少(P<0.01)，Glib组有轻微改善(P<0.05，图3，表6)。Glic组与Glib组相比，Glic能显著抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)；Glic组与Fas组相比，Glic抑制细胞凋亡作用更明显(P<0.05，图3，见彩图页Ⅱ)。

Tab. 6 Myocardial collagen volume fraction and apoptosis fraction in each

2.7 Western blot检测心肌RhoA、ROCK1、eNOS、Bcl-2和Bax的表达

与NC组相比，MC组大鼠心肌组织中RhoA、ROCK1及Bax蛋白水平显著升高，eNOS和Bcl-2表达明显减少(P<0.01，图4，表7)。给予Glic治疗之后，心肌组织中RhoA、ROCK1和Bax蛋白明显降低，eNOS和Bcl-2表达增加(P<0.01或P<0.05)。给予Glib治疗之后，eNOS及Bcl-2蛋白水平有轻微提高(P<0.05)。给予Fas治疗之后，RhoA、ROCK1、Bax蛋白显著降低(P<0.01)，eNOS和Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05，图4)。Glic组与Glib组相比，前者RhoA、ROCK1、Bax蛋白表达明显下降，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05)；与Fas组相比，Glic组Bcl-2蛋白表达上调更加明显(P<0.05，图4，表7)。

Fig. 4 Expressions of RhoA, ROCK1, eNOS, Bcl-2 and Bax in myocardium in each group

Tab. 7 Quantitative analysis of the results of Western blot in each n=5)

3 讨论

糖尿病心肌病(DCM)作为糖尿病严重的并发症之一，早在1972年就曾提出，之后广泛运用于临床医学研究[10]。DCM的主要病理表现为心肌胶原纤维的大量沉积和心肌细胞异常凋亡，纤维化和凋亡共同作用导致心脏收缩功能障碍，最终引发心力衰竭。

为了评价Glic减轻氧化应激和抑制RhoA/ROCK信号通路减轻心肌损伤的作用，并与另一种磺酰脲类降糖药Glib和Rho激酶抑制剂Fas相比较，本实验通过采用高糖高脂饲料合并STZ建立糖尿病大鼠模型。MC组大鼠心脏质量指数增加，通过HE染色发现心肌细胞排列紊乱且细胞发生变形，可见心肌细胞肌浆溶解，Masson染色显示心肌细胞排列紊乱且被染色的阳性面积明显增加，TUNEL染色显示MC组大鼠心肌细胞大量凋亡，可以看出MC组心肌损伤严重，这些符合DCM的病理特征。

Rho蛋白属于小G蛋白Ras超家族，Rho激酶(Rho Kinase，ROCK)是RhoA的效应子，同属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，ROCK1蛋白主要在非神经中组织中表达，并在心血管功能中起调节作用，RhoA蛋白参与细胞的多种生理反应，当RhoA被相关受体激活时，可以调控细胞生长与凋亡以及胶原纤维的生成[11-12]。eNOS作为内皮型一氧化氮合酶是NO的主要生理来源，可以减少血小板聚集，增强心血管抗氧化的能力，维持正常的通透性，糖尿病大鼠缺乏eNOS时会导致心功能紊乱和心肌细胞的凋亡，因此eNOS在调节心血管功能中起到重要作用[13-14]。当RhoA被激活时，下游ROCK蛋白被活化，这种活化能够降低eNOS的mRNA稳定性，最终导致eNOS的表达减少[15]。RhoA/ROCK通路可以通过多种途径参与DCM的发生与发展中，在高糖环境下，RhoA/ROCK通路被激活，心肌中一氧化氮合酶(NOS)生成受阻，导致糖尿病大鼠的心肌抗氧化能力下降，直接或间接损伤心肌组织[16]。RhoA/ROCK信号通路还可以通过调控JNK(c-jun N-terminal Kinase)信号通路，增加Bax蛋白的表达，从而诱导心肌细胞凋亡增加[17]。高糖环境下，RhoA/ROCK通路异常活化可以激活并上调核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的表达，并激活转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)/Smad信号通路，最终导致纤维化的形成[18]。此外，氧化应激也是导致糖尿病大鼠心肌损伤和细胞凋亡加重的原因之一，长期的高血糖状态会损伤线粒体，增加活性氧的生成，并诱导体内抗氧化酶的糖基化，进一步加重体内抗氧化酶活性的下降甚至消失，心肌细胞的抗氧化能力下降，活性氧簇(ROS)直接损伤心肌细胞并导致细胞死亡[19]。

Glic作为第二代磺脲类降糖药物，广泛应用于II型糖尿病的临床治疗。糖尿病大鼠经Glic干预后，大鼠FBG、HWI、HbA1c、TC、TG、LDL-C显著降低，BM、HDL-C水平升高，大鼠血清中MDA含量降低，SOD活性升高，说明Glic可以改善糖尿病大鼠的氧化应激，增强心肌抗氧化能力。通过纤维化染色显示，模型组大鼠发生明显的心肌纤维化，而给予Glic可明显改善糖尿病大鼠的心肌纤维化。通过TUNEL染色可以看出，Glic治疗组心肌细胞凋亡数量显著下降，这一结果与本实验Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达结果一致，Glic组上调Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白水平，Glic可以使糖尿病大鼠心肌组织中RhoA及ROCK1蛋白水平明显减少，eNOS表达上升。

综上所述，糖尿病会造成大鼠心肌损伤，促使大鼠心肌RhoA/ROCK信号通路信号激活，导致糖尿病大鼠发生心肌纤维化和细胞凋亡，进一步加重糖尿病大鼠的心肌损伤。Glic可以通过降低血糖，改善心肌纤维化，缓解糖尿病所致的心肌损伤，还可以改善糖尿病大鼠氧化应激，调控RhoA/ROCK1/eNOS信号通路，减少细胞凋亡，从而对心肌起到保护作用。