试析茶乙香酰胺对人肝癌细胞生长的影响

夏雪倩

（华侨大学医学院，福建泉州362021）

0 引言

结合相关恶性肿瘤而言，肝癌在预后方面相对较差。近年来，无论是发病率，还是病死率均呈现出明显升高趋势[1]。目前，针对肝癌发病机制，在相关临床研究中并没有得到确切结果，因此，结合肝癌治疗，主要以多学科综合治疗为主。肝癌在特点方面，主要包括发病隐匿、发展迅速等，还包括恶性度高，具有较强的转移、侵袭能力，对人体危害十分严重[2]。基于肝癌治疗，临床中涉及方法众多，在患者分期不同的情况下，手术方式也呈现出明显的不同。总体而言，在临床中，多学科联合治疗个体化治疗措施应用已经实现了全面推广，有效促进了肝癌患者的五年生存率。但是，针对肝癌患者而言，疾病的复发、转移仍是医学界的一大难题。因此，相关工作人员应建立在肝脏肿瘤生长抑制作为出发点，完成对相关新型抗肿瘤药物、治疗方案的研究，提高治疗的高效性、低毒性，这也是临床亟需解决的重要问题。

在我国茶叶作为一种饮品，具有较高的受众度。茶氨酸属于氨基酸成分，在茶叶中的存在具有普遍性。针对茶氨酸，其口味相对较为鲜甜，在作为食品添加剂使用的同时，其所具有的生理作用也是人们关注的重点。近年来，以茶氨酸合成技术逐渐成熟化作为背景，对其药理作用的研究也不断深入。相关研究表明，茶叶不仅具有降血脂、降压作用，还具有抗辐射、肿瘤等作用，可有效实现对患者血管的保护，促进其机体免疫力提升[3]。同时，茶叶能够在肿瘤细胞生长中起到一定的抑制作用，使化疗药物在应用过程中，存在的毒副作用得以降低。受到结构、生理特点的影响，茶氨酸在抗肿瘤方面相对较弱。因此，为实现对有效抑制肝癌细胞生长，本文以茶氨酸衍生物TEC作为研究对象，对其抑制作用予以观察。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器

本文研究涉及HepG2细胞系、SMMC7721细胞系，其均来源于中国科学院上海研究所。针对DMEM 高糖培养基、胎牛血清、链霉素、青霉素，其主要来源于美国Hyclone 公司。其中，链霉素、青霉素剂量分别为100μg/mL、100U/mL，在Amersco 公司完成对胰蛋白酶的采购。台盼蓝0.4%，MTT 在Sigma 公司中予以采购。借助有效化学合成方法，完成对TEC的制备。

1.2 仪器

本文涉及仪器使用主要包括：（1）3111 型二氧化碳培养箱，来源于Thermo 公司。（2）TE2000-U 型倒置荧光显微镜，来源于Nikon 公司。（3）离心机，来源于Eppendorf 公司。（4）全自动酶标仪，来源于BIO-RAD公司。

1.3 细胞培养

针对HepG2 细胞、SMMC7721 细胞，完成细胞复苏。选择DMEM 高糖培养液，其中，培养液主要成分为胎牛血清，10%、青链霉素，1%，将细胞置于其中，在培养箱（5%CO2）中进行培养，培养箱应控制在37℃。完成对细胞的观察，在全皿范围内，细胞覆盖程度达到70～80%，在确保其处于正常状态良好的情况下，可进一步予以传代处理。

1.4 MTT检测法

本文主要涉及MTT 比色法的应用，其可有效实现对细胞存活、生长的检测。针对其检测原理，基于活细胞线粒体，借助外源性MTT 还原性，可使琥珀酸脱氢酶转化为蓝紫色结晶甲臜，其具有不溶于水的特性，主要在细胞中进行沉积。其中，针对甲臜，可应用二甲基亚砜予以溶解，使用酶标仪，通过合理波长的选择，完成光吸收值的测定，并以间接形式对活细胞数量予以反映。建立在一定的细胞数量基础上，MTT 结晶量与其呈现为正比例，该方法在临床中已经逐渐普遍化。

具体操作：借助胰蛋白酶（0.25%），完成对数期肝癌细胞的处理，对细胞进行浓度调整，可控制在2*104/mL，在96孔板中，予以接种，以三个复孔完成组别的划分，在二氧化碳培养箱中进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24 小时，在培养完成后，将其与溶媒进行对照，并将TEC 加入其中，具体体积浓度包括16、64、125、250μM。应用培养箱进行培养，培养时间在48 小时、72小时，培养完成后进行取出，结合每个孔位，将MTT 溶液加入其中，具体剂量为10μL，5mg/mL，将温度控制在37℃，完成4 小时孵育，将上清液予以吸去。在各孔位中，进行DMSO 溶解甲臜添加，剂量为150μL，在摇床予以振摇，振摇温度为25℃，时间为15min。借助酶标仪，结合实验情况，予以适宜波长的选择，以630nm作为参考波长，进行校准，最终确定波长为570nm，对各孔吸光度进行测定，完成相应记录后，对细胞相对生长率予以计算。将溶媒作为对照组，设定其为100%，对相关实验组相对生长率加以计算，针对其在肝癌细胞生长中产生的影响进行分析，完成结果评价。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件处理数据，计数资料采用χ2检验，以（%）表示。计量资料采用t检验，以（均数±标准差）表示。P＜0.05 视为差异有统计学意义。

2 结果

本实验主要使用方法为MTT 法。建立在不同浓度基础上，图2 为TEC 在SMMC7721 细胞中的影响，图3 为TEC 在HepG2细胞中的影响。

研究结果表明，在药物浓度增加的情况下，受到作用时间延长的影响，抑制效果增强十分明显，体现出TEC 对时间、剂量的依赖性。在各实验组中，针对SMMC7721细胞生长，均存在抑制作用，效果显著。以实验组、溶媒对照组形成对比，针对HepG2细胞生长，TEC抑制作用相对较弱。

在SMMC7721 细胞中，选择16μMTEC 作用其中，在48 小时、72 小时后，观察细胞生长抑制率，48 小时为26.46%，72 小时为47.18%。选择25μMTEC 作用其中，在48 小时、72 小时后，观察细胞生长抑制率，48 小时为45.73%，72 小时为72.77%。在HepG2细胞中，将16μMTEC作用其中，在48小时后，观察其抑制作用，可发现其并不具有显著性，而将64、125、250μMTEC 作用其中，在48 小时后，呈现出较为明显的抑制作用。在72 小时后，抑制作用出现 增加趋势。其中，64μM 为7.26%，125μM 为37.59%，250μM为56.56%。

图2 在SMMC7721 细胞生长中TEC 的影响。*表示对比溶媒对照组，48h 后差异显著，P＜0.01.#表示对比溶媒对照组，72h后差异显著，P＜0.001。

图3 在HepG2 细胞生长中TEC 的影响。*表示对比溶媒对照组，48h 后差异显著，P＜0.05，#表示对比溶媒对照组，72h 后差异显著，P＜0.05。

3 结论

结合世界上各类恶性肿瘤，肝细胞癌特点较为突出，其属于临床中常见疾病。在我国基于恶性肿瘤，在死亡率方面，肝癌位居第二位，在发病率方面，位居第三位。针对肝癌诊断，常见临床指标包括AFP、超声检查等，还包括CT、磁共振成像、肝穿刺活检等，通过联合肝癌高危因素，实现对肝癌的有效诊断[4]。以肝癌患者治疗效果提升作为出发点，完成对相关高危人群的早期筛查属于关键性步骤，能够促进在早期发现肝癌，落实对其的诊断以及治疗工作。基于肝癌监测，其主要指标为AFP，在肝癌高危人群中，AFP、超声检查是主要的早期筛查手段，在检查中，建议间隔时间应控制在6 个月左右[5]。结合肝癌，中国属于高发地区，就目前而言，其发病仍处于上升趋势，需要借助有效防治手段，实现对肝癌的控制，由此可见，抗肝癌药物的研究具有必要性。在肿瘤治疗中，中医手段历史悠久，其价格相对较为低廉，在低毒副作用方面优势显著。相关研究[6]均表明，为实现抗肿瘤药物的高效性、低毒性，可以中草药作为着手点，有学者[7]强调，相当一部分中草药均具有肿瘤抑制作用。以现代技术发展作为背景，中医药也得到了一定的进步，中药的认可度在全球范围内得到了有效提升。以复方丹参滴丸为例，其在肿瘤治疗临床应用中，效果十分显著，有效实现了对患者生存时间的延长，使其生存质量得以改善。总体而言，传统中医药具有系统抑制肿瘤生长的作用，这也是其在肝癌治疗中的重要优势。

以分子、基因层面展开分析，基于抗肝癌，中药所具有的药效作用机制已经成为行业内关注的重点。在中药复方中，受到其致病机制复杂性的影响，使研究思路更具有独特性[8]。天然茶叶属于中药成分，在茶氨酸中，其存在药理活性种类较多，并且无毒副作用，在安全性方面优势明显，因此，目前常用在食品工业中，作为添加剂使用。但是，针对茶氨酸，其在抗肿瘤药理作用方面相对较弱，因此，本文主要以茶氨酸化合物茶乙香酰胺作为研究对象，对其在肝癌细胞生长方面产生的影响进行分析，可发现其抑制作用相对较强。通过将TEC 应用在临床中，可有效实现对癌细胞生长的抑制，完成对其的迁移、诱导，最终使癌细胞凋亡。结合癌细胞的生长与迁移，基于TEC的抑制作用，具体还与VEGFR/AKT/NF/kB 信号通路密切相关。本文主要围绕肝癌细胞生长，基于茶乙香酰胺，对其抑制作用予以证实，但是针对VEGFR/AKT/NF/kB 信号通路相关性方面，还尚待进一步研究。

结合本文实验，借助MTT 比色法，完成TEC 在HepG2 细胞生长中的影响以及在SMMC7721 细胞生长中的影响。基于MTT，作为黄色染料，在活细胞线粒体中，可将琥珀酸脱氢酶予以还原，形成紫色甲臜，具有不溶性，并在细胞中沉积。在死细胞中，将不具有这种还原性。在甲臜溶解中，其主要借助二甲基亚砜完成，并应用酶标仪，完成对其吸收值的测定，可将活细胞相对数量予以间接形式反映。在本文研究结果中，基于SMMC7721细胞、HepG2细胞生长，TEC 起到的抑制作用十分显著，并且对剂量、时间存在依赖性，该项研究结果也为后续研究奠定了一定的基础。就茶氨酸而言，其来源具有广泛性，价格相对较为低廉，对其进行结构改造，可有效实现抗肿瘤活性的提升，其相关抗肿瘤药物的开发前景十分广阔。