Netrin-1 在类风湿关节炎滑膜组织中的表达及作用研究

王曦晖 薛成 周谅仙 程俊杰

类风湿关节炎 ( rheumatoid arthritis，RA ) 是一种以关节病变为主的慢性全身自身免疫性疾病，目前尚无有效的根治方法[1]。B 细胞在 RA 发生和发展中发挥着关键性的作用，通过抑制 B 细胞的增殖和分化能够有效地缓解 RA 的进展[2]。轴突导向因子 ( Netrin-1 ) 是层粘连蛋白家族的成员之一，近期的研究发现 Netrin-1 能够抑制免疫细胞向炎症部位迁移和募集，进而避免局部炎症反应过度，引起组织的损伤[3-5]。本研究拟探讨了解 Netrin-1 在 RA 患者的滑膜组织中的表达，并探讨其在 B 细胞免疫中的作用，以期为 RA 的治疗提供一个新的靶点。

材料与方法

一、纳入标准与排除标准

1. 纳入标准：RA 组：( 1 ) 符合《 2018 年中国类风湿关节炎诊疗指南》诊断标准[6]；( 2 ) 在我院就诊且行关节镜穿刺活检后病理学检测后确诊的 RA 患者；( 3 ) 年龄在 18～70 岁；( 4 ) 确诊前 6 个月内，未经过免疫抑制治疗。对照组：( 1 ) 于我院就诊的外伤性截肢患者；( 2 ) 年龄在 18～70 岁；( 3 ) 未患有 RA 等疾病；( 4 ) 滑膜组织完整。

2. RA 组排除标准：( 1 ) 合并慢阻肺、糖尿病等慢性疾病者；( 2 ) 艾滋病患者；( 3 ) 乙肝病毒等感染患者；( 4 ) 长期吸烟；( 5 ) 酗酒者。对照组排除标准同 RA 组。

二、一般资料

选取 2012 年 7 月至 2017 年 10 月于本院就诊的经关节镜穿刺活检进行病理学检测证实的膝 RA 患者10 例，作为类风湿组，年龄 21～45 岁，平均 ( 30.3±9.1 ) 岁。同时选取 2012 年 7 月至 2017 年 10 月于本院住院的 10 例外伤性截肢的健康人的滑膜组织作为对照组，年龄 22～43 岁，平均 ( 28.6± 8.5 ) 岁，两组患者一般资料比较，差异无统计学意义 (P＞0.05 )。

三、研究方法

1. 免疫组化：石蜡切片脱蜡至水后，加入 3% 的过氧化氢，室温反应 3 min。之后用 PBS 清洗，羊血清工作液封闭 30 min，滴加 Netrin-1 或者 CD19 的一抗工作液，4 ℃ 过夜。PBS 清洗 3 次后，加入生物素标记二抗工作液，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 清洗。加入碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液， 37 ℃ 孵育 15 min，PBS 清洗。显色剂显色 10 min，清水冲洗，苏木精复染，脱水、透明、封片、拍照后使用 IPP 软件计算各组的平均光密度 ( IOD ) 或者计算阳性细胞的数目。

2. 流式检测外周血中 Breg 的比例：采用梯度离心法分离外周血中的淋巴细胞，PBS 清洗 3 次后，加入 CD19 抗体，室温孵育 20 min 后，PBS 清洗 3 次，之后破膜 30 min，PBS 清洗 3 次后，加入 IL-10 的抗体，室温孵育后 30 min，PBS 洗 3 次，流式检测 CD19＋IL-10＋Breg 的比例。

3. 淋巴细胞的分离和培养：收集 RA 患者的外周血，采用人淋巴细胞分离液分离外周血中的淋巴细胞，收集淋巴细胞，将其置于含有 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基中进行培养。之后分成 3 组：对照组 ( 加入相同体积的 PBS )、低浓度 Netrin-1 组 ( 加入终浓度为 10 ng / ml 的 Netrin-1 ) 和高浓度 Netrin-1 组 ( 加入终浓度为 50 ng / ml 的 Netrin-1 )，刺激 48 h，流式检测 B 细胞和 Breg 的比例。

四、统计学处理

使用 SPSS 15.0 进行统计分析，计量资料用±s表示，采用t检验进行组之间的比较，相关性分析采用 Spearman 分析法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、RA 患者滑膜组织 Netrin-1 表达显著降低

免疫组化的结果显示，经过二氨基联苯胺染色剂将辣根过氧化物酶染成棕色，从图片中能够看出，对照组染色后棕色物质显著对于 RA 组，即相对于对照组，RA 患者滑膜组织中的 Netrin-1 表达显著的降低 ( 图 1 )。

二、RA 患者滑膜组织 B 细胞的数目显著升高

免疫组化的结果显示，RA 组及对照组患者滑膜组织中的 CD19＋B 细胞的数目分别为 ( 64.24± 7.41 ) mm2、( 4.40±1.34 ) mm2，与对照组比较，RA 组滑膜组织中的 CD19＋B 细胞的数目升高了 14.6 倍，差异有统计学意义 (t＝7.471，P＜0.001 )。相关性分析的结果显示 Netrin-1 的表达与 B 细胞的数目，有明显的负相关性 (r＝-0.8049，P＜0.001 ) ( 图 2 )。

三、RA 患者外周血中 Breg 的比例显著降低

流式结果显示，RA 组与对照组患者外周血中 CD19＋B 细胞的比例分别为 ( 2.64±0.38 ) %、( 1.73± 0.22 ) %，与对照组比较，RA 组患者外周血中 CD19＋ B 细胞的比例升高了 1.53%，差异有统计学意义 (t＝ 4.013，P＜0.001 )。RA 组与对照组患者 CD19＋IL-10＋Breg 数目分别为 ( 1.86±0.38 ) %、( 6.58± 0.87 ) %，相对于对照组，RA 组患者 CD19＋IL-10＋ Breg 数目降低了 3.54%，差异有统计学意义 (t＝6.526，P＜0.001 )。相关性分析的结果显示 Netrin-1 的表达与外周血中 Breg 比例具有显著的正相关性 (r＝0.7256，P＜0.001 ) ( 图 3 )。

图 1 RA 患者滑膜组织 Netrin-1 表达显著降低 a ～b：采用 HE 染色，× 200 倍；c～d：采用免疫组化染色，× 200Fig.1 The expression of Netrin-1 in synovial tissues of RA patients was significantly decreased a - b: Stained with HE, × 200; c - d: Stained with immunohistochemical staining, × 200

图 2 RA 患者滑膜组织 B 细胞的数目显著升高 ( *vs. 对照组， P ＜ 0.05；免疫组化染色，× 200 ) Fig.2 The number of B cells in synovial tissues of RA patients was significantly increased ( *vs. control group, P ＜ 0.05; immunohistochemical staining, × 200 )

四、Netrin-1 促进 Breg 比例的升高

体外实验结果显示，RA 组、Netrin-1 低浓度组及 Netrin-1 高浓度组 B 细胞比例分别为 ( 16.27± 3.45 ) %、( 7.33±1.02 ) %、( 4.24±0.68 ) %，与 RA 组比较，Netrin-1 低浓度组及 Netrin-1 高浓度组 B 细胞的比例分别降低了 2.22% 和 3.84%，差异有统计学意义 (t＝3.320，P＝0.029；t＝4.858，P＝ 0.008 )。RA 组、Netrin-1 低浓度组及 Netrin-1 高浓度组 Breg 比例分别为 ( 2.23±0.25 ) %、( 3.57± 0.39 ) %、( 4.61±0.86 ) %，与 RA 组比较，Netrin-1 低浓度组及 Netrin-1 高浓度组 Breg 比例分别上升了 1.60% 和 2.08%，差异有统计学意义 (t＝4.899，P＜0.001；t＝6.887，P＜0.001 ) ( 图 4 )。

讨 论

RA 是一种全身系统性的疾病，目前尚无有效的根治方法，临床上主要进行免疫抑制治疗缓解病情的进展，然而其副作用很大[7]。RA 常常合并神经网络的损害，RA 合并神经系统病变可累及中枢神经、植物神经等。研究表明，通过神经电生理检查发现，RA 患者外周神经病变检测率高达 39.19%[8]。 可见 RA 合并神经疾病病变是 RA 常见的关节外表现之一，但神经分子在 RA 发生和发展中的作用目前还未见相关的报道[9]。本研究了神经分子 Netrin-1 与 RA 的关系，为 RA 的靶向治疗提供了一个新的可能的靶点。

本研究发现，免疫组化结果显示 Netrin-1 在 RA 组患者中表达显著降低。说明 RA 患者呈现 Netrin-1 低表达。进一步分析发现，RA 组 CD19＋B 细胞的数目及外周血 CD19＋B 细胞比例显著高于对照组，CD19＋IL-10＋Breg 数目显著低于对照组。研究发现，与正常人比较，RA 患者外周血中 Breg 的比例显著降低[10]，与本研究结果类似。Breg 是一类具有免疫抑制作用的 B 细胞，能够通过分泌 IL-10 和 TGF-β 等免疫抑制分子，维护机体免疫系统的平衡和稳定[11]。Breg 在 RA 的发生和发展中发挥着关键性作用[12]。

图 3 RA 患者外周血中 Breg 的比例显著降低 ( *vs. 对照组，P ＜ 0.05 ) Fig.3 The proportion of Breg in the peripheral blood of RA patients was significantly decreased ( *vs. control group, P ＜ 0.05 )

图 4 Netrin-1 促进 Breg 比例的升高 ( *vs. RA 组，P ＜ 0.05 ) Fig.4 Nettrin-1 promoted an increase of Breg proportion ( *vs. RA group, P ＜ 0.05 )

本研究发现 RA 患者滑膜组织中 Netrin-1 表达与外周血中 Breg 的比例呈负相关，体外的研究发现 Netrin-1 能够促进 Breg 比例的升高，且具有浓度相关性。Breg 比例的升高能够显著增加 IL-10 的分泌，抑制 Th1 细胞的分化，减少 RA 的发生率[13-14]。 进一步分析发现，Netrin-1 浓度的升高可以显著的降低 B 细胞的比例，Netrin-1 高浓度可以显著提高 Breg 比例。这说明 Netrin-1 可能在 RA 的发生和发展中发挥着重要的作用。Netrin-1 是一种神经分子，具有显著的诱导神经生长和再生的作用[15]。近期的研究发现 Netrin-1 具有强大的免疫调节功能，能够发挥细胞保护和诱导免疫耐受的作用[16]。通过本研究得出的结果，Netrin-1 可能是通过改变 Breg 比例、B 细胞比例等发挥免疫调节作用，进一步发挥对 RA 的作用。

综上所述，Netrin-1 在 RA 滑膜组织中低表达，Netrin-1 可能通过促进 Breg 的分化，对 RA 的治疗具有一定的作用。本研究为 RA 的靶向治疗提供了一个新的可能的靶点。