膝关节骨关节炎患者关节软骨中纳米细菌的检测
2020-03-05彭伟秋张祥洪韦钊岚丘立标张湘生刘傥
彭伟秋 张祥洪 韦钊岚 丘立标 张湘生 刘傥
骨关节炎 ( osteoarthritis,OA ) 是一种常见的关节疾病,是力学和生物学因素作用下软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨三者降解和合成失衡的结 果[1]。OA 的生物学因素非常复杂,国内外对生物学因素的研究主要针对一些细胞因子和炎症介质在 OA 的病理生理中的作用和相互关系,而对正常关节如何产生 OA 的始动病因缺乏有力依据。
早期的研究者认为纳米细菌 ( nanobacteria,NB ) 是一种人畜共患的致病原。新研究认为,NB 是一种具有高仿生特性的有机颗粒 ( calcifying nanoparticles,CNPs ),这种颗粒在形态、生长、增殖和传代培养特性上有着类似于细菌的生物特性,与人类许多病理性钙化和退行性疾病相关[2]。
传统观点认为 OA 是关节内无菌性炎症反应,但却无法解释关节液中常规细菌培养阴性的 OA 患者,其关节液中常发现有脓球、局部发热、肿痛等一系列“感染性”炎症反应,而且对软骨下骨的硬化性病理改变也缺乏合理解释。根据 Tsurumoto 等报道在 2 例人膝 OA 患者的关节液中可检测出 NB,我们分析 NB 可感染机体任何组织细胞的炎症性疾病特性和生物矿化特点与 OA 患者不明原因的“感染性”炎症反应和软骨下骨硬化的病理变化特点后推测:NB 有可能与 OA 的发病有关
本研究通过对膝关节 OA 患者关节软骨中 NB 的检测以探讨 NB 与 OA 的关系,为 OA 的研究提供新线索。
材料与方法
一、纳入标准与排除标准
1. 纳入标准:( 1 ) 2017 年 1 月至 2018 年 3 月,我院收治的晚期膝关节 OA 患者;( 2 ) 膝关节 X 线片示骨赘形成关节间隙狭窄符合膝关节 OA 的诊断标准者;( 3 ) 近 1 个月大多数时间有膝关节疼痛者;( 4 ) 有骨摩擦音者;( 5 ) 关节液检查符合 OA 者; ( 6 ) 签署知情同意书者。
2. 排除标准:( 1 ) 类风湿关节炎患者;( 2 ) 感染性关节炎患者;( 3 ) 痛风性关节炎患者;( 4 ) 有严重并发症及全身感染患者。
二、临床资料
本研究经医院伦理委员会批准。
本研究膝关节骨关节炎组纳入 30 例膝关节 OA 患者的病变关节软骨的标本,正常膝关节组纳入 30 例正常软骨标本。膝关节骨关节炎组关节软骨标本来源于我院行膝关节表面置换术的患者。30 例膝关节 OA 患者中男 12 例,女 18 例;右侧 23 例,左侧 7 例,平均 63.2 岁。正常膝关节组的正常软骨标本来源于急性髌骨脱位与膝外伤致软骨损伤患者关节镜检时收集的创伤性剥脱的软骨颗粒。30 例正常膝关节组男 21 例,女 9 例;右侧 12 例,左侧 18 例;平均 28.5 岁 ( 表 1 )。
表 1 膝关节骨关节炎组与正常膝关节组关节软骨的情况 Tab.1 Articular cartilage characteristics in knee OA group and normal group
三、研究方法
1. 培养方法:无菌条件下将膝关节骨关节炎组和正常膝关节组的软骨用生理盐水反复清洗后用无菌玻璃棒皿研磨成直径 0.5 mm 颗粒,生理盐水稀释过滤离心,取下清液 2 ml 经 0.45 μm 的滤纸过滤。滤液再用生理盐水稀释、离心,取下清液 2 ml 经 0.22 μm 的滤菌器过滤,取滤液 2 ml 与 8 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培养基放在条件为 37 ℃、pH7.4、5% CO2和 95% 空气的细胞培养箱中培养;标本每 6 周换培养液 1 次。
2. 电解质动态监测:每 2 周分别取膝关节骨关节炎组和正常膝关节组的培养液检测,每瓶 1 ml 离心,取上清液送检。
3. NB 鉴定:( 1 ) 光镜观察:每周在光镜下观察膝关节骨关节炎组和正常膝关节组培养液的变化。 ( 2 ) 免疫荧光染色鉴定:分别将培养 6 周膝关节骨关节炎组和正常膝关节组的培养液常温离心,转速 13 200 rpm / min,时间 5 min,吸除上清液,沉淀物用无菌 PBS 液 1 ml 洗涤 2 次,每次洗涤后按上面转速及时间离心,弃上清液,将沉淀用少量 PBS 稀释后涂片,防尘自然风干。用 300 μl 的 3% 的脱脂奶粉液封片 10 min;阳性片加 300 μl 一抗应用液,阴性片加 300 μl 一抗稀释液;防尘保存 1 h,吸干;300 μl PBS 洗 3 次×3 min,吸干;转入暗室操作,加二抗应用液 300 μl,染色 30 min,吸干;PBS 洗 3 次×3 min,在蒸馏水中漂洗 5 s,滤纸吸干后上荧光显微镜观察。在 UV 光下观察,发绿色荧光即为 NB。( 3 ) NB 电镜检查:培养 6 周的膝关节骨关节炎组培养液离心,沉淀物用 3% 戊二醛固定送电镜室进行透视电镜观察。
四、统计学处理
采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析,计量资料采用±s表示,计量资料组间比较采用t检验;计数资料采用χ2分析,检验水准 α 值取双侧 0.05。
结 果
一、电解质检测结果
实验中每 2 周检测 1 次两组培养液中的 K、Na、Cl、Ca、Mg 和 P 的浓度。膝关节骨关节炎组培养 2 周,全部 30 例标本培养液中 Ca、P 的浓度开始下降,且随时间延长其含量逐渐降低,每 2 周一个时间段进行比较,差异有统计学意义 (P=0.02 ),而 K、Na、Cl 和 Mg 没有明显的变化 (P=0.52 ) ( 表 2 )。正常关节组 29 例标本培养液中 K、Na、Cl、Ca、Mg 和 P 浓度 6 周内无明显变化,每 2 周为一个时间段,进行比较,差异无统计学意义 (P=0.51 ) ( 表 3 )。
二、光镜观察结果
膝关节骨关节炎组:2 周时可以看到一些细小颗粒;4 周时小颗粒增多增大贴壁生长;6 周时小颗粒成团片状 ( 图 1a,b )。正常膝关节组:29 例 2 周、4 周、6 周时培养液中没有观察到小颗粒; 1 例可以观察到与膝关节骨关节炎组相似结果。
三、免疫荧光染色鉴定结果
纳米细菌的单克隆抗体行荧光染色鉴定结果:正常膝骨关节组 29 例标本培养液中没有发现 NB ( 图 2a ),1 例发现有发绿色光亮点的 NB,NB 阳性率 3.33%。膝关节骨关节炎组 30 例标本培养液中 NB 的单克隆抗体荧光染色鉴定均发现有发绿色光亮点的 NB ( 图 2b ),NB 阳性率100%。两组比较差异有统计学意义 (P=0.043 ) ( 表 4 )。
四、透射电镜鉴定结果
表 4 膝关节骨关节炎组与正常关节组关节软骨中 NB 检测阳性率比较 ( χ2 )Tab.4 Comparison of the positive rate of NB between the knee OA group and the normal group ( χ2 )
表 2 膝关节骨关节炎组 30 例标本培养过程中电解质随时间的变化 ( x- ± s,mmol / L )Tab.2 Electrolyte changes with time in the culture process of the OA group ( x- ± s, mmol / L)
表 3 正常关节组 30 例标本培养过程中电解质随时间的变化 ( x- ± s,mmol / L )Tab.3 Electrolyte changes with time in the culture process of the normal group ( x- ± s, mmol / L)
图 1 培养 6 周时光镜下观察 a:正常关节组无小颗粒形成;b:膝关节骨关节炎组小颗粒成团片状Fig.1 Observation under light microscope after 6 weeks’ culture a: No small particles were formed in the normal group; b: Small particles were clustered and flaky in the OA group
膝关节骨关节炎组培养 6 周的标本在 30 000 倍透射电镜下可以观察到大小不等、密度较高呈黑色的纳米大小球状或球杆状微粒。同一标 20 000 倍扫描电镜下观到灰白色的球状或球杆状的大小不等纳米颗粒,大小为 80~400 nm ( 图 3a、b )。
讨 论
一、NB 的特性
NB 近年来广受关注和争议。它最先由芬兰科学家 Kajander 发现并命名[3]。早期研究者认为 NB 是一种革兰氏阴性菌,广泛存在于自然界,可感染任何机体的组织细胞致病;NB 除了具有革兰氏阴性菌的特性外,还具有两大基本特征:( 1 ) 菌体直径小,约 50~500 nm;( 2 ) 菌体周围可形成羟磷灰石碳酸盐矿化外壳。最新的研究认为,NB 体积太小,无法携带生命的大分子物质核酸和蛋白质,PCR 检测也无法测出确定的 DNA 或 RNA;NB 属非生物的钙化有机纳米颗粒,具有仿生特性,在形态、生长、增殖和传代培养特性上有着类似于细菌生物特性[4]。尽管关于 NB 是否是微生物存在争议,但是 NB 的支持者与反对者都一致认为:NB 与人类结石类疾病和病理性钙化类疾病密切相关,也与人类退化性疾病密切相关[5-6]。
二、NB 与 OA 的关系
骨是人体内最大的钙化组织,NB 可感染任何生物组织和细胞的特性和 NB 与人类病理性钙化类疾病相关的特点,表明二者关系密切。NB 与骨关节疾病的关系国内相关文献报道少。Tsurumoto 等[7]报道在 2 例 OA 和 4 例类风湿关节炎患者的关节液检测出 NB,但样本数量少,也没有探讨 NB 与 OA 的关系。张名均等[8]研究发现 NB 对人成骨细胞 C3H10 具有细胞毒性作用,主要机制是通过促进细胞凋亡发挥细胞毒作用。同时 NB 能促进钙化相关蛋白 BMP-2 的表达,也能引起凋亡相关蛋白 Bax 的表达升高。石庆新等[9]在探讨类风湿关节炎患者和正常人群血清标本中 NB 分布情况时,对正常人群和类风湿关节炎患者的血清进行 NB 培养和检测,结果正常人和类风湿关节炎患者血清 NB 的阳性检出率分别为 6.7% 和 30.0%,提示类风湿关节炎的发病和 NB 感染可能有关。
三、NB 与膝骨关节的关系
本研究通过对膝关节骨关节炎组和正常膝关节组的关节软骨培养液的电解质的变化检测,发现对人体必需的 K、Na、Cl 和 Mg 元素在两个培养组中无明显变化 (P>0.05 ),但 Ca 和 P 元素在正常关节组中无明显变化 (P>0.05 ) 却在膝关节骨关节炎组浓度逐渐减少,且第 4 周与第 6 周分别与对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05 );这符合 NB 培养过程中需要 Ca、P 但不需要 K、Na、Cl 和 Mg 等元素的特性[10]。这一结果表明膝关节骨关节炎组关节软骨中有 NB 存在。
本研究膝关节骨关节炎组和正常膝关节组标本培养 6 周,进行 NB 单克隆抗体免疫荧光染色鉴定,发现膝关节骨关节炎组全部 30 例标本都发现有发绿色光的 NB 存在,阳性率 100%;正常膝关节组只有 1 例发现 NB,而其它 29 例标本中没有发现 NB,阳性率仅为 3.33%。两组 NB 检测阳性率比较,差异有统计学意义 (P<0.05 ),表明 NB 与膝关节 OA 有着密切关系。这一结果也与 Tsurumoto 等[11]报告的结果一。单克隆抗体免疫荧光染色结果证实膝关节骨关节炎组关节软骨中有 NB。
正常关节组中有 1 例也检测到 NB 的可能原因有:( 1 ) 被检测对象是 OA 的早期;( 2 ) 由于约 8% 的健康中国人血清中存在有 NB,被检测对象是 NB 携带者;( 3 ) 培养标本感染 NB[12]。
膝关节骨关节炎组的 NB 电镜检测,可以观察到球状或球杆状、具有矿化外壳的 NB 颗粒,测量其大小约为 80~400 nm,这与文献报道的结果相似[10]。电镜结果证实膝关节 OA 患者的关节软骨中有 NB。
虽然关于 NB 的讨论还在继续,但 NB 的肾结石动物模型[13]和胆囊结石动物模型[14]的成功复制为本研究提供了新方法。本研究结果显示膝关节 OA 患者关节软骨中 NB 的培养检测阳性率 100%,而正常膝关节软骨中 NB 的检测阳性率仅为 3.33%。表明 NB 与 OA 密切相关,NB 可能与 OA 的发病有关。