软骨寡聚基质蛋白基因多态性与常染色体显性早熟性膝关节骨关节病的关系

王刚 祝雁冰 关中伟

膝关节骨关节病是一种常染色体显性遗传性骨软骨发育不良，其特征在于关节软骨的退化，软骨下骨的重塑，骨赘形成和硬化[1]。多种致病机制与膝关节骨关节炎的严重程度和进展有关，早熟性膝关节骨关节炎是指在 40 岁之前发生的病症，有很强的遗传相关性[2]。从疾病的第一个症状开始，通常需要 10～15 年才能变得严重和衰弱[3-4]。许多候选基因，主要是那些编码细胞外基质结构蛋白的基因，已经被鉴定为特发性膝关节骨关节病的潜在易感基因座[5]。软骨寡聚基质蛋白 ( cartilage oligomeric matrix protein，COMP ) 是一种细胞外基质蛋白，主要在软骨和骨组织中表达[6]。假性软骨发育不全 ( pseudoachondroplasia，PSACH ) 和多发性骨骺发育异常 ( muffiple epiphyseal dysplaais，MED ) 的患者报告了 100 多种 COMP 突变，但在已鉴定出 COMP 的外显子 15，17 和 19 中没有任何突变[7]。COMP 基因突变与常染色体显性早熟性膝关节骨关节病可能存在关联[8]，而且目前的研究认为基因多态性可以影响基因的表达水平。膝关节骨关节病的诊断通常主要基于家族史，临床表现，体格检查，放射学评估和基因诊断。然而，膝关节骨关节病的准确诊断有时可能很困难，特别是对于非专业医生而言，并且由于临床表现在膝关节骨关节病个体之间存在显著差异，因此大多数放射学检查变化并非疾病特异性且 DNA 检测费用昂贵且未广泛使用[9]。然而，尚未探索 COMP 水平变化作为膝关节骨关节病患者的诊断标志物。本研究拟探讨 COMP 基因多态性与常染色体显性早熟性膝关节骨关节病的关系和 COMP 水平作为膝关节骨关节病生物标志物的潜在效用。

资料与方法

一、纳入标准与排除标准

1. 纳入标准：( 1 ) 确诊为膝关节骨关节病患者；患者来自于同一家族；( 2 ) 受试者自愿加入本研究。

2. 排除标准：( 1 ) 风湿性关节炎者；( 2 ) 痛风性关节炎的者；( 3 ) 不同意参加该研究者；( 4 ) 患有严重的精神疾病者。

二、一般资料

2017 年 3 月至 2018 年 2 月，我院鉴定并招募具有常染色体显性早熟性膝关节骨关节病的六代家族，招募了来自该家族的 32 例膝关节骨关节病患者，用于表型评估和基因分型，还招募了 55 名年龄匹配的健康对照受试者。所有参与本研究的受试者，均行 X 线片检查评估关节受损情况 ( 注：获得六代家族的临床资料的途径是本研究团队所在科室多年来持续随访关注该家族的工作成果 )。

本研究得到了机构审查委员会的批准，每位参与者或其法定代表人均签署书面知情同意书。

三、方法

1. 体格检查和实验室检查：所有研究参与者均接受常规病史和体格检查，由 3 名副主任医师在本院风湿免疫学系独立风湿病专家的监督下进行。记录患者的年龄，疾病持续时间，晨僵持续时间，关节压痛指数、关节肿胀指数、关节活动疼痛指数和关节静息疼痛指数。使用 Axiom Aristos VX Plus 手部 X 线片数字 X 线摄影系统 ( 西门子 )，以确定关节骨损伤的程度。

2. 基因多态性分型：使用 Puregene DNA Isolation Kit ( Gentra Systems，Minneapolis，MN，USA ) 根据制造商的说明提取基因组 DNA。使用 ABI PRISM Linkage Mapping Set v 2.5 HD5 ( Applied Biosystems，Foster City，CA，USA ) 对 400 个高度多态性微卫星标记进行基因分型。标记物的平均杂合度为 0.72%，估计间距为 10 cm。使用 GeneMapper 软件程序 ( Applied Biosystems ) 计算等位基因大小。使用 SAS 程序执行等位基因呼叫和分级。

3. DNA 测序：使用 Applied Biosystems 3730 DNA 分析仪通过直接测序确定所有 19 个外显子和外显子-内含子连接的 COMP DNA 序列变体。使用 Primer3 程序 ( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ ) 设计用于聚合酶链反应 ( PCR ) 的引物。PCR 反应在 50 μl 的最终体积中进行，每个引物含有 0.2 μM， 5 mm Tris-HCl ( pH 8.3 )，5 mm KCl，1.5 mm Mgcl2，0.01 mm EDTA，0.05 mm DTT，200 μM dNTP 和 2.5 μl 位 Taq。扩增条件包括在 94 ℃ 下初始变性 3 min，然后在 94 ℃ 下进行 20 个触地 PCR 循环 30 s，在 65 ℃ 下 30 s ( 每个循环降低 0.5 ℃ )，在 72 ℃ 下 40 s，最后 20 个循环，在 94 ℃ 下 30 s，在 55 ℃ 下 30 s，在 72 ℃ 下 40 s ( 表 1 )。

表 1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence

4. 血浆 COMP 和抗 CCP 抗体测定：选择 32 名膝关节骨关节病家族的第 4 代、第 5 代、第 6 代膝关节骨关节病患者。对照组是从医院随机选择的，所选择的参与者分别与 32 例膝关节骨关节病个体的年龄相匹配。将 5 ml 静脉血样品收集到 IMPROVACUTER®EDTAK2 管 ( IMPROVE MEDICAL Technology，Guangzhou，China ) 中。将血液样品在室温下以 2000 g 离心 20 min，在 BY-320C 离心机 ( Baiyang Medical Instrument Company，Beijing，China ) 中保存，并在 -80 ℃ 下保存直至分析。根据制造商的说明，使用 ImmunoscanCCPlus®酶联免疫吸附测定 ( Euro Diagnostica，Malmo，Sweden ) 分析抗 CCP 水平，并且最小可检测浓度为 0.1 U / L。使用 Human COMP 酶联免疫吸附测定法 ( Kamiya Biomedical Company，Seattle，WA，USA ) 根据制造商的说明书测量血清 COMP 水平。最低可检测浓度为 0.4 ng / ml，并且测定内和测定间变异系数均＜5%。每个测量一式三份进行。

5. 膝关节骨关节炎指数评分：为了评价膝骨关节的功能，使用西安大略省和麦克马斯特大学 ( The Western Ontario and McMaster Universities，WOMAC ) 膝关节骨关节炎指数评分，这是一种经过验证且广泛使用的测量膝关节骨关节炎患者下肢疼痛和功能状态的方法。对疼痛和功能分别使用线性变换对响应进行求和并缩放为 0～100。WOMAC 膝关节骨关节炎评分包含三个分量表，即僵硬亚表 ( 范围 0～8，最高僵硬水平 8 )，功能亚表 ( 范围 0～68，最低功能水平 68 ) 和疼痛亚表 ( 范围 0～20，疼痛最高水平 20 )，分数越高表示疼痛越大，功能越差。

四、统计学处理

使用 SPSS Version 17.0 软件 ( SPSS Inc.，Chicago，IL，US ) 进行统计学分析。使用 GraphPad Prism 5.0 软件将所有数据表示为±s。使用非参数 Mann-WhitneyU检验和 Student’st检验确定组间差异。分类数据以n个患者 ( % ) 表示，使用 Pearsonχ2检验或 Fisher 精确检验分析分类变量之间的差异。P值＜0.05，被认为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般情况

本实验共纳入 87 名受试者，其中 32 名根据体格检查和影像学检查结果被诊断为膝关节骨关节病患者，平均年龄为 ( 44.16±9.27 ) 岁，膝关节骨关节病组性别、年龄、体重和身体质量指数与对照组相比，差异无统计学意义P＞0.05 )，而膝关节骨关节病患者身高较低，臂跨度较窄，差异有统计学意义 (P＜0.05 ) ( 表 2 )。

二、COMP 蛋白结构

COMP 是一种模块蛋白，由氨基末端卷曲螺旋寡聚化结构域、4 种表皮生长因子重复结构域，8 种钙调蛋白重复结构域和羧基末端球状结构域组成，COMP 在哺乳动物物种中是非常保守的，并且在不同发育阶段表现出不同的表达模式，表明其在转录调节过程中受到严格控制，并且它是哺乳动物软组织发育中的重要调节因子 ( 图 1 )。

三、COMP 多态性

图 1 COMP 蛋白结构Fig. 1 COMP protein structure

表 2 患者身体指标统计Tab.2 Statistics of body indices

通过基因型检测，在本研究条件下，膝关节骨关节病家族的 COMP 外显子 15 中鉴定发现一个新的变体 ( 1675 碱基-G 突变为 A，559 氨基酸-谷氨酸突变为赖氨酸 )，统计所有受试者 COMP 基因型，膝关节骨关节病组 COMP 基因突变频率高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05 ) ( 表 3 )。

表 3 COMP 基因突变频率与膝关节骨关节病关系Tab.3 Relationship between COMP gene mutation frequency and knee osteoarthritis

四、WOMAC 膝关节骨关节炎指数评分

WOMAC 膝关节骨关节炎指数评分结果显示，COMP 突变 A 等位基因与 COMP 正常 G 等位基因相比，WOMAC 膝关节骨关节炎指数评分增加，膝关节骨关节病组 WOMAC 膝关节骨关节炎指数评分高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05 ) ( 表 4 )。

表 4 WOMAC 膝骨关节炎指数评分Tab.4 WOMAC knee osteoarthritis index

五、膝关节骨关节病患者骨骼放射学检查

本实验通过放射学检查受试者骨骼，X 线片显示，膝关节骨关节病患者手很小，趾骨和掌骨短而粗，有锥形的骨骺；脊柱侧凸，上下脊柱的距离变宽；胫骨和腓骨轻度缩短，膝内翻；骨盆无线电图显示髋臼角增大，髋关节间隙变窄，股骨头变平，股骨头不规则，颈部缩短 ( 图 2 )。

六、膝关节骨关节病家族代数与发病年龄关系

COMP 基因突变和发病年龄因家庭成员而异。随着家族代数增加，COMP 基因突变频率增加，平均发病年龄降低，第 4 代发病年龄为 ( 39.17± 8.64 ) 岁，第 5 代发病年龄为 ( 28.36±6.43 ) 岁，第 6 代发病年龄为 ( 14.13±3.51 ) 岁，差异有统计学意义 (P＜0.05 ) ( 表 5 )。

表 5 膝关节骨关节病家族代数与发病年龄关系Tab.5 Relationship between family algebra and age at onset

七、血浆 COMP 和抗 CCP 抗体水平

使用酶联免疫吸附测定试剂盒检测 COMP 和抗 CCP 抗体水平，与对照组相比，膝关节骨关节病组 COMP 和抗 CCP 抗体水平均明显升高，膝关节骨关节病组 COMP 突变 A 等位基因 COMP 和抗 CCP 抗体水平均高于 COMP 正常 G 等位基因，差异有统计学意义 (P＜0.05 ) ( 表 6 )。

表 6 血浆 COMP 和抗 CCP 抗体水平Tab.6 Plasma COMP and anti-CCP levels

图 2 膝关节骨关节病患者骨骼放射学检查Fig.2 Radiographs of patients with knee osteoarthritis

讨 论

COMP 基因含有 19 个外显子，编码 552 kDa 五聚体黏附糖蛋白，主要在软骨，韧带和肌腱中表 达[10]。COMP 是一种模块蛋白，含有氨基末端结构域，4 个表皮生长因子重复序列，8 个钙调蛋白重复序列以及 1 个大的羧基末端球状结构域[11-12]。绝大多数先前鉴定的 COMP 突变 ( 约 95% ) 聚集在外显子 8-14 内，其余 5% 的突变位于外显子 16 和 18 中[7,13]。这些包括点突变，其导致保守残基的单氨基酸取代和删除一个或多个残基的密码子的框内缺 失[14-16]。位于染色体 19p12 上的 COMP 基因的外显子 18 中鉴定的 c.2152 C＞T 取代导致 718 位的疏水性色氨酸对于带正电荷的精氨酸的非保守取代，该突变位于 COMP 的 C 末端球状结构域中[17]。虽然没有对色氨酸取代进行功能分析，但精氨酸的 718 位置在整个物种中是保守的，包括倭黑猩猩、牛科动物、马、小鼠和大鼠[18]。本研究发现 32 个个体在 COMP 基因中携带 c.1675G＞ A 突变，其中 19 个受影响并显示经典的膝关节骨关节病表型，13 个没有突变，但具有膝关节骨关节病的共同特征和放射学研究，平均发病年龄为 ( 30.26±3.68 ) 岁，可能是具有多因素遗传的膝关节骨关节病。外显子 15 本课题组长期随访筛选的关键突变位点。

膝关节骨关节病组 COMP 水平均明显升高，表明 COMP 可作为区分膝关节骨关节病患者和健康个体的有用实验室标志物，也可用于判断疾病的严重程度。在本研究中，抗 CCP 水平也被测量，与健康对照受试者相比，OA 患者的抗 CCP 水平显著升高，抗 CCP 水平显示出高特异性和低敏感性，用于区分膝关节骨关节病患者和健康对照受试者。骨骼的成像特征在骨骼的骨破坏阶段经常发生变化，基于体格检查，X 线片结果的早期诊断可能对建立治疗策略没有用。因此，骨关节功能障碍的早期评估需要具有高灵敏度和特异性的方法。在本研究中，血清 COMP 水平证明了用于区分膝关节骨关节病患者和健康对照受试者的可接受的诊断性能。COMP 水平为 21.51 ng / ml 是区分 OA 患者和健康个体的最佳临界值。

本研究有一些局限性。首先，样本是从当地医院中选出的，这可能会对结果的推断产生一些限制。因此，在推断本研究结果时，应考虑样本的代表性。其次，研究中的患者持续时间相对较长，因此个体的 COMP 值可能受多种因素的影响，这可能会影响最佳的临界值。

综上所述，本研究表明 COMP 基因多态性与常染色体显性早熟性膝关节骨关节病紧密相关，血清 COMP 水平有可能被用作 RA 中软骨代谢的生物学标志物。血清 COMP 的临界值为 21.51 ng / ml 可用于区分 RA 患者和健康个体。