植酸酶及其应用前景(综述)(续1)

张相鑫 译自，Vol.54(2018)，№4：352～360

唐彩琰 校

2 植酸酶的特性

植酸酶属于磷酸酶类(EC 3.1.3.)，可催化植酸盐水解去除无机磷酸盐。这些酶主要来自植物、细菌和真菌。许多种类的细菌和真菌含有3-植酸酶(EC 3.1.3.8)，该酶从植酸第3个碳原子上的磷酸基团开始水解。植物和大肠埃希菌均可表达6-植酸酶(EC 3.1.3.26)，其首先水解第6个碳原子上的化学键。3-植酸酶水解的终产物是L-肌醇-2-磷酸酯，而6-植酸酶可使底物完全去磷酸化。此外，研究人员也鉴定出了5-植酸酶(EC 3.1.3.72)，该酶从第5个碳原子处启动磷酸分解反应。研究表明，酪氨酸磷酸酶(PTPLP)也具有植酸酶活性，可以使用肌醇多磷酸盐作为底物。肌醇多磷酸盐的水解从肌醇的第3个或第4个碳原子开始，形成磷酸盐和肌醇-1,2-二磷酸。

根据结构和催化植酸磷酸盐分解机制的不同，植酸酶可被分为组氨酸酸性磷酸酶(Histidine Acidic Phosphatases，HAPs)、β-螺旋植酸酶 (β-Propelleric Phytases，BPPs)、紫色酸性磷酸酶(Purple Acidic Phosphatases，PAPs)和具有植酸酶活性的酪氨酸磷酸酶。

HAPs含有保守的组氨酸氮端(N-)和碳端(C-)。在催化过程中，酶的N-端和C-端彼此靠近形成催化中心，磷酸的两步分解发生在该催化中心。大多数细菌和部分真菌如枝孢菌属(Cladosporium sp.)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、泡盛曲霉菌(Aspergillus awamori)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)能够分泌HAPs。曲霉属(Aspergillius sp.)的植酸酶被广泛用作猪和家禽的饲料添加剂。HAPs在酸性介质(最适pH为4.5～6.0)中具有活性。在此条件下，植酸盐失去金属离子成为植酸，植酸与植酸酶带正电荷的催化中心亲和。用螯合剂去除金属离子可提高植酸酶的活性。HAPs可非特异性水解磷酯，如ATP、AMP、果糖-1,6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸和对硝基苯酚磷酸盐等。并非所有的HAPs都有植酸酶活性。

BPPs(EC 3.1.3.8)广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中。该植酸酶因具有特殊的空间结构而得名，它们拥有一种类似六叶螺旋桨的结构。BPPs还包括一些碱性植酸酶，这些酶在pH大于7时水解植酸。碱性植酸酶最先在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中被鉴定出。植物[如宽叶香蒲(Typha latifolia)和百合(Lilium longixorum)等]的花粉中也发现了碱性BPPs。研究人员在土壤细菌如淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和左乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)中发现了胞外碱性植酸酶。碱性植酸酶的X射线结构分析不仅显示了它们的特殊结构，还显示了两个磷酸基团和六个钙离子可能结合的氨基酸形成位点。钙离子在这个反应中作为辅助因子。

显然，植酸酶可参与微生物的某些生理反应。BPPs敲除的枯草芽孢杆菌菌株的生长效率降低，尤其是在pH、温度和盐浓度未达到最适水平的情况下。

细菌、真菌和动物均能分泌PAPs，其中以植物的最为广泛。PAPs因呈现粉红色或紫色而得名，这是由于它们的催化中心含有Fe3+，其他金属离子还有锌(也参与催化)、二价铁和锰。该PAPs主要结构还包括参与金属螯合的保守性氨基酸序列。植物基因组含有许多被鉴定为PAPs编码基因的基因。然而，并不是所有的PAPs都具有植酸酶活性。这表明这些植酸酶不仅参与磷酸盐、肌醇和金属离子的代谢，还具有一些其他功能。试验表明，PAPs参与植物抵抗热应激、氧化应激和盐化应激等过程，还具有过氧化物酶活性。

PTPLPs也被称为半胱氨酸植酸酶，其活性中心拥有CX5R(S/T)结构域，它需要结合参与水解的磷酸。PTPLPs不能识别酪氨酸磷酸酶的特有底物。该酶最早从反刍动物瘤胃中的反刍兽月形单胞菌和埃氏巨型球菌中分离得到。从δ-变形杆菌噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)分离的PTPLP对肌醇六磷酸酯具有高度特异性。

3 植酸酶活性的检测方法

植酸酶活性既可以利用微生物学方法测定，也可以利用化学方法测定。前一种方法基于微生物能在以植酸为唯一磷源的培养基中生长；化学方法则根据最终反应产物的浓度测量，即无机磷酸盐或磷酸肌醇衍生物的浓度。微生物学方法可以筛查细菌和真菌是否具有植酸酶活性。但是，这些方法比较耗时，且只能提供植酸酶活性的粗略值。因此还需要利用其他方法来估算其活性，并揭示反应机制。

目前广泛应用的测定无机磷酸盐(inorganic Phosphate，Pi)浓度的分光光度法基于Fiske和Subbarow在1925年提出的方法。在该方法中，反应产物(Pi)在酸性介质中与钼酸铵相互作用，形成可吸收355 nm波长光的黄色钼酸。一些改进方法将钼酸进一步还原为钼蓝，其浓度可用分光光度法(波长700 nm)测量。该反应会用多种化合物作为还原剂，包括1-氨基-2-萘酚-4-磺酸、硫酸铁、抗坏血酸和氯化锡。高效离子色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)无需更改就可用于估算无机磷酸盐浓度。基于无机磷酸盐形成来估算植酸酶活性的方法有一个重大缺点，即研究样品中存在其他磷酸酶，随着含磷酸盐化合物水解的增多，机体无机磷酸盐储备可能增加。因此，研究人员已经开发出一种高灵敏度方法，用于估算产物色谱分离后的植酸酶活性，并利用肌醇脱氢酶定量测定肌醇的水平。

利用HPLC可以对底物水解过程中产生的磷酸肌醇衍生物进行鉴定，还可以确定植酸分子中磷酸盐开始水解的位置，同时追溯整个水解过程，并明确其最终产物的特征。基于高效液相色谱法提出的方法是为了分析磷酸肌醇衍生物[40]。

研究人员以植酸-溶菌酶复合物为底物，开发出了一种可以快速估算碱性BPPs和HAPs包括3-植酸酶和6-植酸酶活性的方法。

(未完待续)