铜或镉胁迫对海洋青鳉生理生化指标及产卵量的影响

孙金辉 潘 霞 徐永健 颜 鑫 谢尚端

(1. 天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384; 2. 宁波大学海洋学院, 宁波 315211)

重金属是常见的海洋污染物, 主要由人类生产生活产生并被携带至海中[1,2]。由于重金属的毒性、持久性以及生物累积的特性, 会对人类、生物和自然生态系统构成严重威胁[3,4]。如铜能影响生物体内的酶系统[5], 会导致生理受阻, 发育停滞[6],急性铜中毒会刺激胃肠道黏膜, 慢性中毒则会引起肝硬化[7]; 镉为“五毒之首”, 有致畸、致癌特性, 镉污染会使动物酶系统受到抑制[8,9], 长期受镉影响会损伤肾、肺、肝[10]等, 会使卵母细胞成活率、受精率降低, 最终导致不孕不育[11]。

海洋青鳉(Oryzias melastigma)是一种新兴的海水模式生物, 对水质和环境变化极敏感, 是毒理学上至关重要的监测物种[12,13]。相比斑马鱼(Barchydanio rerio)和日本青鳉(Oryzias latipes), 其在培养条件、生理、行为及分子信息等方面具有明显优势[14,15], 是海洋环境毒理学上有应用潜力的重要生物监测种类[16—18], 已被国际生命科学学会(ILSI)认定为毒理学研究的重要模式生物[19], 也是国际标准组织(ISO)推荐的毒性实验标准用鱼之一[20]。研究海洋青鳉能够扩充海洋生态毒理模式的生物领域, 丰富不同污染条件下海洋青鳉的反应情况, 为日后海洋污染生态学和模式生物的研究发展打好基础[21]。

利用日本青鳉监测淡水水质的相关方法已较为成熟, 通过识别鱼的行为判断水质是否发生变化[22,23]。应用该方法所建立的纯生物传感技术, 现已能精确地判断水质的污染状态, 并可根据行为差异进行污染程度划分[23]。而利用海洋青鳉进行海水水质监测的相关方法和技术较日本青鳉比还有很大的差距, 目前涉及海洋青鳉的研究, 主要以幼鱼较多[24], 成鱼较少; 高浓度重金属胁迫较多, 低浓度胁迫较少。

本文以海洋青鳉成鱼作为实验生物, 分析不同浓度铜、镉胁迫下鱼体的一些生理生化指标变化,以乳酸(LA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性来反应胁迫对鱼体体能消耗的影响[25], 以睾酮(T)、促卵泡激素(FSH)和促黄体生成素(LH)含量和产卵量来反应胁迫对鱼体生殖能力的影响。把环境胁迫-能量消耗-生殖能力下降等现象联系起来, 反映一些化学监测、物理监测甚至常规生物监测都难以发现的低浓度毒物对生物有机体的慢性和深度影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

海洋青鳉鱼卵由厦门大学王克坚老师实验室惠赠, 已于本实验室成功扩繁五代以上。扩繁条件： 水温： 28—30℃, 盐度： 28—30, 光照： 8000 lx, 光照周期： L14h∶D10h, 饵料： 新孵化卤虫幼体。试验用的青鳉成鱼为4—5月龄, 是正常繁殖群体。雄鱼体全长为(4.0±0.25) cm、体重(0.52±0.13) g, 雌鱼体全长为(3.5±0.19) cm、体重(0.45±0.11) g。

1.2 实验设计

以海水水质标准为参考, 依据文献[26]报道设置铜和镉的浓度梯度。铜(CuSO4·5H2O(AR)配制)设3个梯度： C1： 1/10的96hLC50(0.017 mg/L), C2：1/2的96hLC50(0.087 mg/L), C3： 96hLC50(0.174 mg/L); 镉[CdCl2·2.5H2O (AR)]3个梯度： G1： 1/10的96hLC50(0.650 mg/L), G2： 1/2的96hLC50(3.249 mg/L), G3： 96hLC50(6.497 mg/L)。每个处理3个重复,并设置一个空白组作对照(C0/G0)。每组放养青鳉成鱼20尾(雌雄各半), 养殖水体30 L, 养殖海水用自来水+海水晶(广州益尔生物工程有限公司)配制, 条件同扩繁条件。每日清理养殖缸中的排泄物并更换约20%同浓度现配海水。分别于4d和15d, 在吸污换水时收集沉底的卵, 计数后统计各处理的产卵情况, 计算单尾雌鱼的平均产卵量(粒)。

试验共持续15d(28℃时青鳉一个繁殖周期)。分别于4d和15d取样, 测定LA、LDH、T、FSH和LH。每次从每组中随机捞取雌雄各3尾鱼, 用蒸馏水冲洗2—3遍, 加入5 mL 0.9%生理盐水并匀浆,3000×g低温(4℃)离心10min后取上清, 然后根据检测试剂盒(购于上海源叶生物技术有限公司)说明书的操作步骤测定LA、LDH、T、LH和FSH等指标。

1.3 数据分析方法

实验结果利用Microsoft Excel和SAS 8.01 软件进行统计分析, 采用单因素方差分析(ANOVA), 并选取Duncan法对实验组进行比较,P＜0.05 表示有显著性差异。

2 结果

2.1 铜或镉胁迫对海洋青鳉成鱼中LA含量的影响

如图1所示, 在试验过程中, 对照组前后LA含量无显著性差异, 雌雄个体间也无显著性差异(P＞0.05)。

图1 不同浓度铜或镉胁迫下海洋青鳉的乳酸(LA)含量变化Fig. 1 The lactic acid contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

铜胁迫4d, 不同浓度处理组的LA含量出现了较大变化, 总体上随铜浓度升高而LA含量下降, 与C0相比, C1显著上升、C2持平、C3显著下降;C1上升主要是雌鱼的LA大幅升高所致, 该浓度对雄鱼影响不大; C2铜浓度对雌鱼和雄鱼有相反的影响, 两者平均后与对照无差异; C3铜浓度对两性都有影响, 雌鱼影响类似于C2, 而雄鱼的LA含量非常低, 仅为14.4 mmol/L, 远低于对照及其他处理。至15d, 鱼体中的LA含量仍然是随着铜浓度的升高而显著下降。所有处理都低于对照组, 其中, C1的雌鱼近似对照, 雄鱼有较低值; C2两者都低于C1和对照, 雄鱼大大低于雌鱼; C3类似于C2, 其中雄鱼与C2相近, 雌鱼低于C2, 因此整体不如C2 (P＜0.05)。

镉胁迫4d, 不同浓度处理青鳉鱼体内的LA变化与铜胁迫时有所不同。整体上, LA含量随镉浓度的升高而升高, 随胁迫时间的延长而下降。G1处理仅比G0略低, G2高于G0, G3最高, 两两组间差异显著(P＜0.05)。对性别的影响, 雄性的LA含量都低于雌性, 差异显著(P＜0.05), 此外G1与G2中雄鱼的LA相似, 并低于G3。至15d, 各处理的LA含量进一步下降, 胁迫组的LA含量都比对照组低(P＜0.05)。对性别的影响, 除G1外其余处理中雄鱼要低于雌鱼(图1)。

2.2 铜或镉胁迫对海洋青鳉成鱼中LDH活性的影响

在实验过程中, 对照组青鳉体内的LDH活性无显著性差异(P＞0.05)。铜胁迫4d, C2低于对照, 而C1与C3组高于对照, 后两者间差异不显著; 其中,C1雌鱼的LDH活性较雄鱼强, C2相似, 而C3则相反, 雄鱼的LDH活性强于雌鱼。至15d, 各处理的LDH活性进一步下降, C1处理主要是雄鱼的下降造成, C2是雌鱼下降明显, 而C3两性同时都下降。

镉胁迫4d (图2), 与对照比较, G1和G3的LDH活性略有下降, G2下降最多。其中, G1和G2处理, 镉对雌雄鱼的影响相近, 而G3中雄鱼LDH活性下降更显著。至15d, 各处理的LDH活性都有较大的升高。G1升高最为明显, 雌鱼比雄鱼升高更多;G2恢复到与对照相似水平, G3比对照稍高一点(P＜0.05)。

图2 不同浓度铜或镉胁迫下海洋青鳉体内乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化Fig. 2 Lactate dehydrogenase activities of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

2.3 铜或镉胁迫对海洋青鳉成鱼中T含量的影响

在试验过程中, 对照组前后鱼体中的T含量无显著性差异(P＞0.05)。铜胁迫4d, 各处理的T含量都有所上升, 升幅相近。其中C1中雌鱼较雄鱼上升多, 而C2和C3却相反。至15d, 各处理的T含量都下降, 其中C3下降最为明显。两性间的差异类似于第4天, 其中比较特别的是C2处理, 雄鱼保持着高于对照水平的T含量, 但雌鱼下降很大; C3两性都下降,也是雌鱼下降更大。

在镉胁迫时, T含量随镉浓度的升高而升高, 其中G1与对照相近, G2和G3高于对照(P＜0.05)。胁迫4d时, 3个处理雌鱼的T含量都升高了, 且升幅大于雄鱼。至15d, G1处理与对照相近, G2和G3处理都高于对照, 雄鱼的含量高于雌鱼(图3)。

2.4 铜或镉胁迫对海洋青鳉成鱼中FSH含量的影响

在试验期间, 对照处理中鱼体的FSH含量前后也无显著性差异(P＞0.05)。铜胁迫4d, 仅C2略低于对照, C1和C3与对照无差异。对性别的影响, 也仅C3, 雌鱼略有上升, 而雄鱼略有下降。至15d, C1比第4天略有下降, 但C2和C3的FSH都有大的降幅,C3的降幅最大, 与C2间有差异(P＜0.05)。各组中两性间的差异不大。镉胁迫4d, 3个处理中FSH都略有下降, 其中G2降幅最大。在所有处理中, 雄鱼的降幅都大于雌鱼。至15d, 各处理中FSH含量都上升了。其中, G1和G3已接近于对照, 而G2略低于对照。雌雄间基本无差别(图4)。

2.5 铜或镉胁迫对海洋青鳉成鱼中LH含量的影响

在试验期间, 对照组中鱼体的LH含量前后无显著性差异(P＞0.05, 图5)。铜胁迫4d, 各组与对照相似, 性别间也无差异。至15d, 各组的LH含量都降低了, 且随铜浓度升高而下降越明显(P＜0.05), 但性别间仍无差异。镉胁迫4d, G1略有下降, G2降幅较大, 而G3与对照相似。所有处理雄鱼的降幅都大于雌鱼。至15d, 各处理中LH含量都有所恢复。G1和G3 都接近于对照, 而G2略低于对照。

图3 不同浓度铜或镉胁迫下海洋青鳉鱼体内睾酮(T)含量的变化Fig. 3 Testosterone contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

图4 不同浓度铜或镉胁迫下海洋青鳉体内促卵泡素(FSH)含量的变化Fig. 4 Follicle stimulating hormone contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

图5 不同浓度铜或镉胁迫下海洋青鳉体内促黄体生成素(LH)含量的变化Fig. 5 Luteinizing hormone contents of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

2.6 铜或镉胁迫对海洋青鳉成鱼产卵量的影响

在试验过程中, 所有处理都未出现海洋青鳉死亡现象。短时间(4d)的铜胁迫对产卵量基本没有影响, 但随着胁迫时间的延长(15d)和胁迫浓度的升高, 海洋青鳉产卵量下降非常明显(图6)。而短时(4d)的镉胁迫, 仅高浓度(G2)处理的产卵量有所下降(P＜0.05); 随胁迫时间的延长(15d)和胁迫浓度的升高, 各处理中海洋青鳉的产卵量逐渐相近(P＞0.05), 并与第4天相比不存在显著差异(P＞0.05,图6)。

2.7 各指标间相互关系分析

在海洋青鳉鱼铜或镉胁迫下各指标间的相关性分析见图7。铜或镉胁迫对青鳉的LA含量影响是不同的, 随铜浓度的升高而降低, 随镉浓度的升高而升高(图7a、7b)。随铜或镉胁迫时间的延长,雌雄鱼体内LA含量均降低。在雌鱼受铜或镉胁迫时, 体内T含量与LA含量呈正相关关系, 铜胁迫的相关性系数大于镉胁迫(图7c、7d), T与FSH/LH间也有良好的正相关关系。此外, 短期(4d)内铜胁迫对雌鱼产卵量没有影响, 但长期(15d)胁迫明显影响产卵量, 并随浓度升高而生殖能力下降(图7e)。而镉胁迫对产卵量有急性影响(仅中间浓度(G2)处理), 长期无影响, 且与浓度间也无密切关系(图7f)。同时回归分析也表明, LA与产卵量间、重金属离子与产卵量也有密切关系, 而回归方程的参数体现了不同离子胁迫的影响差异 (图7g、7h)。

图6 不同浓度铜或镉胁迫对海洋青鳉产卵的影响Fig. 6 Fecundities of Oryzias melastigma under different concentrations of cadmium or copper

图7 铜或镉胁迫过程中鱼体各指标间的关系分析Fig. 7 Correlative analysis of related indicators of fish in copper or cadmium poisoning test

3 讨论

机体疲劳主要体现为能量或肌肉力量的下降[27],表现为一系列生化指标的变化, 如乳酸(LA)上升、血尿素氮(BUN)上升和乳酸脱氢酶(LDH)活性上升等[28,29]。肌肉中LA增加会导致氢离子浓度升高, 从而造成机体疲劳, LDH作用是催化LA重新形成丙酮酸, 消除LA积累[30]。因此, LA和LDH两个指标可以用来反应机体疲劳及能量消耗程度[31]。在本试验中, 海洋青鳉体内的LA水平(图1), 短期铜胁迫时有所升高, 而后逐渐减少到低于对照组。一是表明鱼体逐渐适应了铜的低毒胁迫, 生理状态逐渐恢复;二是低浓度的铜离子有生物活性作用, 微量的重金属对水体中的生物是有益的[32]。而镉胁迫与铜胁迫刚好相反, 随镉浓度升高而显著上升, 尽管随着鱼体的适应LA略有下调, 但仍保持在高位状态。从LDH的变化也能看出(图2), 铜胁迫前期略有升高后逐渐下降, 而镉胁迫下LDH活性逐渐增强。LDH活性可反应机体能量代谢的水平, 肌体受损也会导致LDH活性增高[33,34]。从上述的LA和LDH变化看, 海洋青鳉对铜胁迫的适应快, LDH也无较大的波动, 表明低浓度铜基本没有对海洋青鳉造成损伤, 仅在前期抗胁迫中机体能量有所消耗。而镉胁迫短期内没有出现太大影响, 但到试验后期海洋青鳉才表现出疲劳损伤特性(LDH活性高)。睾酮(T)也有一定的消除疲劳功效[35]。在本试验中T与LDH的变化较为吻合, 表明T可能与LDH共同作用,减少体内LA的积累。但T的变化存在着两性间的差异性(图3), 低浓度重金属的胁迫对雌鱼T的影响更大些, 浓度下降也更明显。因此, 从结果看雄鱼的抗疲劳能力提高了, 而雌鱼T下降, 疲劳程度却加重了。根据相关分析分析(图7), LA与雌鱼T间有很强的相关性(图7c、7d), 可以推断雌鱼受到铜或镉胁迫后, LA含量发生改变, 进而引起T与LDH的相应变化。而铜、镉所造成的胁迫效应不同, 应该与鱼体对不同毒物的适应能力有关。

作为性激素, T还对精子发生、卵泡发育及维持性器官正常有重要意义[36], 在雌性和雄性的生殖生理过程中都很重要[37]。一般认为, T通过调控FSH和LH的合成与分泌, 发挥生理作用[36,38,39], 本试验也显示T与FSH/LH间有良好的正相关关系。而FSH/LH与雌性的产卵密切相关[40—42]。本试验在铜或镉胁迫下的海洋青鳉体内FSH变化显著(图4),但整体趋势与T相似。因此, 可以推断雌鱼T含量与其产卵量间也存在密切的正相关关系。前述中, 雌鱼对重金属较敏感, 体内的T变化比较大, 因此对产卵量的影响也比较大。LA与T间有良好的关系, 但根据上述的分析, 应该是LA升高, 而后LDH和T升高以消除LA积累, LDH和T的上升应该要滞后于LA的变化(从本实验看, 这种滞后的时间应该是不同的毒物是不一样的, 这需进一步进行验证)。可以推断LA升高造成产卵量减少, 当然是由于个体适应或抵抗毒物胁迫消耗能量所致, 如铜胁迫试验结果; 至于镉胁迫, 由于青鳉对镉适应比较慢, 本试验养殖时间不足, 因此产卵量下降现象还未出现。综上, 可以初步建立以下的动态关系： 雌性青鳉的LA水平(疲劳程度)-T/FSH(激素变化)-产卵量(繁殖能力)。可以利用这个关系链开展环境胁迫程度的分析。尽管铜或镉低浓度胁迫均对海洋青鳉的生理生化产生影响, 且有关的生理生化指标间存在较好的相关性。但是, 有机体内的各项指标都是动态变化的, 而水生生物对低浓度重金属也有适应性,只有超出了机体的调节能力, 才会影响到生物的生理稳态[43]。不过, 通过本实验发现, 生物对不同重金属种类的响应不同, 且存在性别差异, 还有采样的时间点等都会对结果产生影响, 影响结果的准确性。因此, 还需要开展更多的试验研究, 完善相关关系链分析, 为准确开展生物监测提供依据。

4 结论

综上所述, 本研究发现低浓度的铜或镉胁迫都会影响海洋青鳉的生理生化指标, 且这种影响呈现出明显的性别差异性。低浓度的铜或镉胁迫导致雌性青鳉体内的LA升高, 限制了性激素(T、FSH)分泌, 从而导致产卵量下降, 且这种关系与铜或镉浓度间呈正相关关系, 并随胁迫时间的延长而效应下降。但铜或镉胁迫对这种关系的影响也有较大的差异, 如对应的相关回归方程的斜率、系数及变化周期等。