标准桃金娘油减轻PM2.5致大鼠气道黏液纤毛的损伤

杜 宁，刘小强，段 争

(1.邯郸市第一医院东区 呼吸内科，河北 邯郸 056001；2.河北省环境监测中心，河北 石家庄 050051； 3.河北医科大学第二医院 呼吸二科，河北 石家庄 050000)

呼吸系统作为细颗粒物进入人体的门户，可受到大气细颗粒物(动力学当量直径小于或等于2.5 μm,fine particulate matter,PM2.5)直接或间接的影响，是其暴露的重要靶器官[1-2]。黏液纤毛清除系统(mucociliary clearance,MCC)作为呼吸道重要的防御机制之一，当机体受到香烟烟雾、粉尘和感染等因素影响，可引起黏液纤毛清除系统功能损伤。PM2.5对黏液纤毛清除系统的影响在多种呼吸系统疾病的发生发展中起促进作用[3-4]。对机体的影响受PM2.5来源、暴露浓度和暴露时间等多种因素的影响。目前研究多为急性暴露模型，长期慢性暴露模型因造模困难、暴露周期长、花费较大和耗费人力等原因使用较少，但其对机体的损伤机制多不同于急性暴露，能更好的模拟人群自然生存条件下的健康效应。标准桃金娘油肠溶胶囊(myrtol standardized，又称标准桃金娘油)是一种黏液溶解性祛痰药，作用于上、下呼吸道黏膜发挥溶解黏液、刺激纤毛摆动，增强黏液纤毛清除系统功能[6]。本实验通过采取直接暴露于大气污染比较严重的石家庄市自然雾霾大气中，观察接近自然状态下PM2.5暴露对MCC的影响及标准桃金娘油干预的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，(220±20)g，48只(河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号：1501089)。

1.1.2 主要试剂：标准桃金娘油肠溶胶囊(德国希尔制药有限公司)；小鼠抗大鼠MUC5AC单克隆抗体(GeneTex公司)；小鼠SP检测试剂盒和DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；AB-PAS(alcian blue-periodic acid sthiff)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；反转录试剂盒、蛋白marker(30～460 ku)(Thermo Fisher公司)；扩增试剂盒(浙江爱必梦生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：N(N3,N6)组大鼠吸入空气净化器过滤的清洁大气，PM(PM3,PM6)组大鼠吸入室外雾霾空气(PM2.5浓度的范围29.90～99.65 mg/m3)，PM+CS组大鼠灌胃标准桃金娘油混悬液300 mg/(kg·d)。暴露3和6个月后，麻醉处死大鼠，留取标本。

1.2.2 气管和肺组织染色：常规制片，行HE和AB-PAS染色，光镜观察黏液细胞化生及行病理炎行反应分级(参照文献分4级)，采集图像，以Image Pro-P1us 6.0医学图像分析软件分析，得出数据。

1.2.3 扫描电镜观察气管：取上段气管，2.5%戊二醛固定液固定，送检扫描电镜。

1.2.4 BALF中细胞计数和分类：常规收集BALF液，4 ℃ 1 000 r/min 离心6 min。细胞计数板行细胞计数，瑞士-吉姆萨染色后行细胞分类，共计数200个细胞。

1.2.5 Real-time PCR：Trizol法提取总RNA，用紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度(A260/A280比值)；按反转录试剂盒操作说明将总RNA反转录成cDNA，-20 ℃或-80 ℃存储。引物由上海英潍捷基贸易有限公司设计合成，序列如下：GAPDH：上游引物5′-ACTCTACCCACGGCAAGTTC-3′，下游引物5′-TGGGTTTCCCGTTGATGACC-3′；MUC5AC：上游引物5′-ACCGACCAGGTACACCGATA-3′，下游引物5′-CAACCTCCCATGCCATCTGT-3′；AQP5：上游引物5′-AAAGGGACGACAGCTTGCTT-3′，下游引物5′-TCCG TGAGCCATCTATCCCT-3′；按扩增试剂盒操作说明进行cDNA扩增，采用F=2-△△CT计算各组基因相对表达量。

1.2.6 免疫组化染色检测MUC5AC蛋白表达：石蜡切片经烤片、脱蜡至水、3% H2O2灭活内源性过氧化物酶、微波抗原修复，余步骤按说明书进行。采集图像，以Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肺及气管组织病理学改变

PM组气管壁充血、水肿和炎性细胞浸润，鳞状上皮细胞增生，纤毛排列紊乱，肺组织可见不同程度的炎性浸润、肺泡壁断裂融合、肺泡腔萎陷和肺间质增生等损伤(图1)。

2.2 各组AB-PAS染色相对着色面积比较

PM组细胞黏液化生情况较N组显著增加(P<0.05)，而标准桃金娘油可减轻细胞黏液化生情况(P<0.05)(图2，表1)。

2.3 扫描电镜结果比较

PM2.5可致大鼠纤毛呈不同程度损伤，纤毛稀疏，排列紊乱，黏连及倒伏明显，而标准桃金娘油可减轻纤毛损伤情况(图3)。

2.4 BALF中细胞计数及分类的比较

PM2.5可致BALF中白细胞总数、中性粒细胞计数、中性粒细胞百分比升高，PM组显著高于N组、PM+CS组(P<0.05)(表2)。

2.5 基因表达水平比较

MUC5AC mRNA表达水平PM组显著高于N组、PM+CS组(P<0.05)，而AQP5 mRNA表达水平PM组显著低于N组、PM+CS组(P<0.05)(表3)。

2.6 MUC5AC蛋白表达水平比较

PM组MUC5AC蛋白表达显著高于N组、PM+CS组(P<0.05)(图4，5，表4，5)。

3 讨论

肺脏作为细颗粒物进入人体的门户， 根据吸入气体颗粒物粒径大小、形态、电荷等特性的不同，人体通过鼻腔的滤过作用、MCC的清除功能、巨噬细胞的吞噬功能等多种方式清除吸入的颗粒物[7-8]。MCC作为呼吸道重要的防御机制之一，当其受损时，可引起微生物及颗粒物清除障碍，进而导致呼吸系统疾病的发生。PM2.5暴露损伤MCC的具体的损伤机制尚不明确。本研究采取大鼠直接暴露于石家庄市自然雾霾大气中，建立PM2.5慢性暴露的动物模型，探讨PM2.5慢性暴露对MCC的损伤机制。黏液纤毛清除系统高效的工作需要盐和水的转运、黏蛋白的合成和分泌、纤毛协调摆动三者之间恰当的调节过程。黏液细胞化生可表现为黏蛋白基因和编码黏蛋白糖基化的基因表达水平的改变，从而黏蛋白分泌增加。实验证实PM2.5暴露可使致敏大鼠黏液细胞化生[9-10]，破坏气道黏膜-纤毛屏障，使微生物及异物的清除障碍[3-4]。MUC5AC是呼吸道黏液的主要组成部分，PM2.5暴露可刺激MUC5AC分泌增加[11]。AQP5是介导水跨膜转运的膜蛋白，在气管水的转运并维持细胞内外水平衡、调节黏液分泌等过程中发挥重要作用，但AQP5与MUC5AC表达之间的相关性尚不明确[12-13]。本研究显示PM2.5可致纤毛结构损伤和肺炎性损伤，并诱导黏液高分泌，标准桃金娘油在一定程度可减轻PM2.5对黏液纤毛清除系统损伤，但不能逆转和阻止其损伤作用。

A.N3 group; B.PM3 group; C.PM3+CS group; D.N6 group; E.PM6 group; F.PM6+CS group图1 各组大鼠支气管HE染色Fig 1 Bronchium tissues of rats among groups(×200,HE)

A.N3 group; B.PM3 group; C.PM3+CS group; D.N6 group; E.PM6 group; F.PM6+CS group图2 各组大鼠AB-PAS染色结果Fig 2 AB-PAS staining results of rat in different groups (×200)

表1 各组大鼠肺组织AB-PAS染色阳性表达面积的比较Table 1 Comparison of positive expression acreage(Aep) by AB-PAS staining in rat lung tissues of different

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

A.N3 group; B.PM3 group; C.PM3+CS group; D.N6 group; E.PM6 group; F.PM6+CS group图3 各组大鼠扫描电镜观察结果Fig 3 Observed results by scanning electron microscopy in different groups(×2 000)

表2 各组大鼠BALF细胞计数和分类的比较Table 2 Comparison of cell count and classification in BALF of different

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

表3 各组大鼠肺组织MUC5AC mRNA和AQP5 mRNA表达水平的比较Table 3 Comparison of MUC5AC and AQP5 gene expression level in lung tissue of n=8)

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

图5 Western blot检测MUC5AC蛋白表达Fig 5 Expression of MUC5AC protein detected by Western blot

综上所述，PM2.5作为大气污染物，可损伤气道防御机制，引起黏液纤毛清除系统功能减低，微生物和颗粒物清除障碍，从而反复感染加重肺脏损伤，这可能是PM2.5引起呼吸系统损伤的重要机制之一，而标准桃金娘油作为一种黏液溶解性祛痰药，能一定程度减轻其损伤作用。目前PM2.5参与损伤的具体信号传导途径尚不明确，需进一步实验阐明。

表4 各组大鼠肺组织MUC5AC蛋白表达水平的比较Table 4 Immumohistochemical staining of MUC5AC protein in different

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.

表5 各组大鼠肺组织MUC5AC蛋白表达水平的比较Table 5 MUC5AC protein levels in lung tissue of

*P<0.05 compared with N group;#P<0.05 compared with PM group.