姜黄素减轻小鼠深部组织压力性损伤

刘盼盼，张子锐，杨 旭，韩 晶，陆连芳，王爱敏，张 菊*

(1.青岛大学 护理学院 山东 青岛 266000； 2.青岛大学附属医院 肝胆外科， 山东 青岛 266000)

压力性损伤(pressure injury, PI)，又名压力性溃疡或褥疮，据统计，在中国综合性医院压力性损伤发生率为3% ～ 14%[1]。其中深部组织压力性损伤(deep tissue pressure injury, DTPI)由于其病情隐匿、发展迅速以及治疗成本高等特点引起临床伤口专家们的高度重视。其常见于移动能力受限患者的骨突强烈或长期受力部位，主要因局部组织缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)引起血管内皮损伤并启动炎性反应，进而导致微循环障碍、毛细血管网密度减少[2]。因此，选择有效的药物治疗深部组织压力性损伤，已成为近年来医学研究的热点。

姜黄素(curcumin,Cur)是一种从中药材姜黄中提取的植物多酚，也是姜黄最主要的活性成分[3]。研究表明，姜黄素能够减轻小鼠糖尿病足溃疡损伤，提示姜黄素可能对慢性伤口损伤有一定的保护作用，但其能否减轻缺血-再灌注导致的深部组织压力性损伤尚有待研究[4-5]。基于此，本实验拟评价姜黄素对缺血-再灌注导致的小鼠深部组织压力性损伤的影响，初步探讨其分子作用机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂：姜黄素(Sigma-Aldrich公司)；IL-6、IL-10、VEGF-α、TGF-β和TNF-α引物(青岛德罗海达生物技术有限公司合成)；Stat3、p-Stat3、VEGF-α和TGF-β单克隆抗体(万类生物科技有限公司)；其他有机分析纯试剂(青岛德瑞康生物科技有限公司)。

1.1.2 实验动物：SPF级8 ～ 10周龄雄性C57BL/6小鼠30只，体质量20 ～ 22 g(北京维通利华实验动物技术有限公司，生产合格证：SCXK京2016-0006)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：按照以往文献报道的方法建立小鼠深部组织压力性损伤模型[6]。腹腔注射4%水合氯醛7.5 mL/kg麻醉小鼠后，用剃毛器除去背部被毛，选择小鼠坐骨棘突附近皮肤组织施压，在施压处上下两侧各放置一块相同磁铁(直径12 mm，厚5 mm，重2.4 g，表面磁通量为1 000高斯)。施压12 h后释放12 h为1个循环，共1个循环。施压期间小鼠正常进食、活动。采用随机数字表法将小鼠随机分为模型组(Mod)、姜黄素4 mg/kg组(Cur 4)、姜黄素8 mg/kg组(Cur 8)，每组10只。另取10只正常小鼠作为对照组 (Con)。以模型构建成功为第0天，于1、3、5、7、9、11和13天，平均每只小鼠体质量按20 g计算，Cur 4组的每只小鼠创面皮下注射0.8 g/L姜黄素0.1 mL，Cur 8组的每只小鼠创面皮下注射1.6 g/L姜黄素0.1 mL。对照组和模型组小鼠不做任何处理。

1.2.2 伤口愈合状况测定：建模后第1、3、5、7、10、12和14天在相同条件下于小鼠局部创面拍照，使用Image J软件统计伤口面积。以第3天伤口面积为基准，伤口愈合百分比=未愈合伤口面积/第3天伤口面积。

1.2.3 HE染色：于第14天颈椎脱臼法处死小鼠，取创面及周围1 cm皮肤组织，固定于4%多聚甲醛，制作石蜡切片，进行HE染色，光镜下观察。

1.2.4 Real-time PCR检测mRNA表达：Trizol法提取伤口组织总mRNA，反转录试剂盒构建cDNA。Q-PCR检测借助荧光定量PCR试剂盒，设置程序：95 ℃ 15 min; 95 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，40次循环；扩增反应完成后进行熔解曲线制作。结果以2-ΔΔCt表示。引物序列见表1。

1.2.5 Western blot检测目的蛋白：取冻存的皮肤肌肉组织样本，匀浆化后向裂解液内加入等体积含十二烷基硫酸钠的蛋白缓冲液，水浴锅内煮沸10 min，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min后收集上清液。采用BCA蛋白分析试剂盒测定样本内蛋白浓度，用SDS-PAGE分离蛋白质，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜。常温下用含5%脱脂奶粉封闭1 h，经TBST溶液清洗2次后加入适度稀释的第一抗体(VEGF-α、TGF-β、Stat3、p-Stat3、β-actin)，4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育1 h，最后加入底物并曝光、显影。

表1 引物序列Table 1 Sequence of the primers

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 创面愈合过程大体观察

3组小鼠建模后第1天，创面呈苍白色圆形，创周清晰整齐。深部组织压力性损伤第3天，3组创面边缘逐渐模糊，颜色加深。第5天，3组创面均扩大、不同程度凹陷，颜色进一步加深呈黄褐色。第7天，模型组创面进一步恶化发展，而干预组创面出现缩小态势。第10天，模型组创面缩小但是颜色加深呈深褐色，Cur 8组伤口面积明显缩小，创缘处可见结痂。第12～14天，模型组创面缓慢缩小，部分结痂覆盖；Cur 8组创面完全结痂覆盖，且见结痂与创缘分离，周围粉色新生上皮覆盖明显。3组小鼠的创面愈合宏观情况见图1。

图1 小鼠DTPI的创面愈合情况Fig 1 Wound healing of DTPI in mice

2.2 创面愈合比

以完全上皮覆盖作为创面愈合的依据，不同时间点的创面愈合比(表2)。深部组织压力性损伤后第7、10、12和14天，Cur 8组小鼠创面愈合比均分别显著低于模型组(P<0.05)；Cur 4组只在第7、10天创面愈合比低于模型组(P<0.05)，其第14天创面愈合比与模型组无显著差别。

表2 姜黄素对小鼠创面愈合比的影响Table 2 Effect of curcumin on wound healing ratio in n=3)

*P<0.05 compared with model group.

2.3 伤口组织形态学观察

实验第14 天，组织切片染色结果(图2)。相比对照组，模型组创面肉芽组织较少，可见少量成纤维细胞、中性粒细胞及毛细血管。相比模型组，Cur 8组肉芽组织更为丰富，可见较多的成纤维细胞、胶原纤维及新生毛细血管。Cur 4组病理改变介于模型组与Cur 8组之间。

*P<0.05 compared with model group图2 DTPI后第14天的组织形态学观察Fig 2 Histological examination at day 14 after DTPI(HE staining×100)

2.4 创面组织中相关因子mRNA的表达

深部组织压力性损伤第14天，与对照组相比，模型组TGF-β、IL-10和VEGF-α的mRNA表达显著减少(P<0.05)，IL-6和TNF-α的mRNA表达显著增多(P<0.05)。Cur 4和Cur 8组创面组织中IL-6和TNF-α的mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05)；而Cur 8组创面组织中VEGF-α、IL-10和TGF-β含量明显高于模型组(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with model group图3 小鼠创面组织中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF-α、TGF-β mRNA表达Fig 3 mRNA expression of TNF-α, IL-6, IL-10, VEGF-α, TGF-β and HIF-1α in the wound n=3)

2.5 创面组织中相关因子蛋白的表达

与对照组相比，模型组VEGF-α、TGF-β和p-Stat3蛋白表达减少(P<0.05)。Cur 8组VEGF-α、TGF-β和p-Stat3蛋白较模型组明显升高(P<0.05)，Cur 4组TGF-β和p-Stat3蛋白较模型组表达增加(P<0.05)，而3组实验中Stat3蛋白含量无明显区别(图4)。

*P<0.05 compared with model group图4 DTPI中p-Stat3、Stat3、 TGF-β 和 VEGF-α的蛋白表达Fig 4 Expression of p-Stat3, Stat3, TGF-β and VEGF-α in the DTPI in n=3)

3 讨论

姜黄素具有抗感染、抗氧化、抗癌等多种药理作用，临床上常用于治疗鼻炎、呼吸道疾病和肠道疾病等[7]，其对改善缺血-再灌注引起的肾损伤、脑损伤及炎性反应等有很好的疗效[8]，但姜黄素在缺血-再灌注引起的深部组织压力性损伤中的保护作用及分子机制仍不明确。

深部组织压力性损伤是由于骨突部位持续的机械力导致的多层组织坏死，持续的炎性反应和血管密度骤减是其难以愈合的关键因素[9-10]。本实验中局部注射姜黄素后， 创面愈合率优于未处理模型组。HE结果表明，相比模型组，Cur 8组出现更多的毛细血管结构、新生血管和血管壁增厚现象。与模型组相比，Cur 8组中IL-6和TNF-α的表达量显著降低，而IL-10的表达量显著增加。尤其，姜黄素可使深部组织压力性损伤后组织中VEGF-α和TGF-β的表达量增加，该研究结果与报道一致[11]。IL-6和TNF-α是参与机体炎性反应的重要炎性介质，且TNF-α可诱导成纤维细胞凋亡，抑制胶原沉积，阻碍伤口愈合；而IL-10是一种存在于缺血组织中的抗炎细胞因子，能刺激创面肉芽组织形成，是组织修复中的重要细胞因子之一。说明姜黄素可以减轻深部组织压力性损伤中的炎性反应。

同时，本研究初步探索了姜黄素在深部组织压力性损伤中的分子作用机制。JAK-STAT信号通路在机体的应激与炎性反应及创伤修复中发挥重要作用[12]。STATs对细胞因子信号的传递具有特异性， STAT3活化后成为p-STAT3, 能诱导细胞分化、凋亡及血管生成等生物学行为相关的下游靶基因的表达, 且VEGF启动子上存有STAT3的结合位点序列[13]。Cur 8组p-STAT3、VEGF-α表达较模型组明显增加，可见姜黄素激活STAT3进而诱导VEGF-α的表达，VEGF作为一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂源，进一步诱导新生血管形成，促进肉芽组织生成，从而加快创面愈合，实现促进小鼠深部组织压力性损伤血管新生的作用。

综上所述，8 mg/kg 姜黄素对于保护小鼠深部组织压力性损伤效果显著，且组织炎性反应抑制及血管再生促进可能与姜黄素激活JAK-STAT信号通路直接相关。但姜黄素是否通过直接靶向作用于STAT3，姜黄素的治疗剂量以及在临床中是否具有同样治疗效果还有待后期进一步深入研究验证。