甘草种子携带真菌检测与致病性分析△

徐秀兰，尚兴朴，马丽娟，芦钰，王玉玺，邱艳红，张海军，吴萍*

1.北京市农林科学院 蔬菜研究中心，北京 100097；2.中国中药有限公司，北京 100195；3.河北科技师范学院 农学与生物科技系，河北 秦皇岛 066004；4.中国农业大学 植物保护学院，北京 100093

甘草GlycyrrhizauralensisFisch以根和根茎入药，具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛等功效，能调和百草，素有“十方九草”之美誉，是我国市场需求旺盛的中药[1]。野生甘草多生长于三北地区[2]，是构成我国北方荒漠植被的重要植物，具备生态和经济的双重价值，对环境资源保护起着不可替代的作用[3]。甘草不仅广泛应用于中医临床，其制品甘草浸膏、甘草酸粉盐等在食品、保健品、化妆品、烟草、轻工等许多行业也备受青睐，国际市场的需求量日益增长。2016年，我国甘草及制品的进口量为2.8万t，进口额达37 000万美元[4]。

甘草病害的发生及危害一直都是影响甘草产量及其品质最主要的限制因素。据报道，目前我国甘草主要病害包括锈病、根腐病、褐斑病、白粉病、猝倒病和立枯病等真菌性病害[5]。种子药剂处理是提高播种品质和防治种传病害最简单、经济有效的方法[6]。本研究旨在对甘草种子进行内外部携带真菌检测，并对种传真菌的致病性进行测试，为甘草种子药剂处理预防种传病害提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(批号：DL114-01，博迈德生物有限公司)；乳酸葡萄糖培养基(aPDA，批号：BCBN5254V，Fluka公司)；乳酸(批号：20180312，福晨化学试剂有限公司)；98%硫酸溶液(批号：20160318，光复科技发展有限公司)。

Centrifuge 5424 R型高速离心机、Centrifuge 5810 R型高速离心机、MLX-204型瞬时离心机(Eppendorf中国有限公司)；XT5408-GC380TL2型光照培养箱(杭州雪中炭恒温技术有限公司)；T110型PCR仪(Bio-Rad公司)；LDZF-50KB型灭菌锅(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；ShockMixer-1型脉冲震荡样品前处理器(广东环凯微生物科技有限公司)。

4个批次来自不同产区的甘草种子样品，未经任何加工处理于常温下在编织袋中保存。样品为中国中药有限公司提供，由中国中药有限公司王继永研究员鉴定为GlycyrrhizauralensisFisch的种子。4个批次的种子均收获于2018年。批次A产自新疆维吾尔自治区焉耆县；批次B产自新疆维吾尔自治区阿勒泰地区；批次C产自内蒙古自治区赤峰市；批次D产自甘肃省会宁县。种子样品扦取参考InternationalRulesforSeedTesting第2章扦样，在随机选取的不同种子袋中抽取等量初次样品，混合后为送检样品[7]。

1.2 方法

1.2.1种子外部带菌检测 随机选取4个批次甘草种子各10 g(1000粒)分别放入均质袋内，加入无菌水20 mL拍打60 s，吸取全部悬浮液，12 000 r·min-1离心10 min(离心半径为16 cm)，除去上清液，加入1 mL无菌水均匀悬浮沉淀，取适量悬浮液进行梯度稀释，分别稀释1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4，每个稀释梯度菌悬液吸取100 μL均匀涂布到aPDA培养基上，每个浓度重复3次，置于28 ℃恒温箱中培养2～3 d，观察记录平板上的菌落总数，根据稀释倍数和检测种子数计算种子外部携带的孢子负荷量和检出真菌的分离比例。每个供试种子批次重复4次。

孢子负荷量=3皿菌落总数/0.3 mL×稀释倍数/1000

(1)

分离比例=(某类真菌菌落个数/菌落总数)×100%

(2)

1.2.2种子内部带菌检测 4个批次甘草种子样品随机选取100粒种子作为1个重复，用75%乙醇浸泡30 s，1%次氯酸钠溶液浸泡3 min，然后用无菌水冲洗3次，晾干，将种子均匀摆放在aPDA平板上，每个平板上摆放20粒，共5皿，置于28 ℃恒温培养2～3 d，观察并记录平板上的菌落总数并拍照，每个供试品种批次设置4个重复。

随机选取4个批次甘草各100粒，用98%硫酸浸泡50 min，然后用无菌水冲洗3次，晾干。将种子均匀摆放在aPDA平板上，每个平板上摆20粒，共5皿，置于28 ℃恒温培养2～3 d，观察并记录平板上的菌落总数并拍照，每个供试品种样品重复4次。根据公式(3)～(4)计算种子带菌率和分离频率。

种子带菌率=(带菌种子数/检测种子总数)×100%

(3)

分离频率=(带某类菌种子数/带菌种子数)×100%

(4)

1.2.3真菌形态学鉴定 将分离到的不同种类的真菌转移到aPDA培养基上进行纯化，然后通过显微镜观察菌丝和孢子的形态，结合真菌培养性状和形态学特征，参考相关工具书和文献鉴定到属[8-10]。

1.2.4真菌分子鉴定 收集在aPDA培养基培养4 d的真菌菌丝至1.5 mL离心管中，分别编号，放入液氮中充分冷却后取出研磨充分。采用核酸快速提取试剂盒，按照操作使用说明提取DNA，提取的DNA质量浓度稀释到50 ng·μL-1，保存在-20 ℃。

以上述提取总DNA为模板，用真菌通用引物内转录间隔区(ITS)1/ITS4进行PCR扩增[11]。扩增体系为2×mix 2 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，ddH2O 19 μL，检测样品 2 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，终止温度在4 ℃。反应结束后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物测序，通过BLAST序列比对，鉴定到属、种。

1.2.5甘草种子芽率与幼苗发病率测定 将甘草种子浸泡于98%硫酸 25 ℃处理50 min，至种皮表面破损出现均匀小点，在超净工作台上用无菌水洗净晾干，取100粒播种于灭菌的基质中，设置4次重复，于7、14 d记录种子发芽率，同时观察并记录幼苗发病情况。

1.2.6真菌致病性测定 将甘草幼苗每盆移植2株，放入光照(20 ℃，16 h光照，8 h黑暗)培养箱培养，在幼苗生长12 d时进行实验。将纯化的6个真菌菌株(曲霉、链格孢、毛霉、尖孢镰刀菌、芽枝状枝孢霉、立枯丝核菌)在aPDA培养基上28 ℃培养4～5 d，形成一定大小的菌落。用灭菌的打孔器在菌落靠近边缘处打取菌饼(Φ=6 mm)，将菌饼贴附于甘草幼苗茎基部，每个菌株处理3株幼苗作为重复。对照组采用无菌的aPDA琼脂块(Φ=6 mm)贴附于甘草幼苗茎基部。接种完毕后将甘草幼苗放在光照培养箱中(25 ℃，16 h/8 h、光照/黑暗)继续培养，观察其发病情况。将上述处理后甘草幼苗的发病部位用75%酒精消毒，切取片段放入aPDA平板中培养，分离纯化后按照1.2.3、1.2.4项下进行形态学、分子学鉴定。

2 结果与分析

2.1 种传真菌鉴定

2.1.1种传真菌形态学鉴定结果 如图1所示，根据真菌的形态和在显微镜下菌丝与孢子的形态初步确定分离得到部分菌株为链格孢属Alternariaspp.、青霉属Penicilliumspp.和曲霉属Aspergillusspp.真菌。

注：A.链格孢属Alternaria sp.菌落形态；B.青霉属Penicillium sp.菌落形态；C.曲霉属Aspergillus sp.菌落形态；D.链格孢属Alternaria sp.在显微镜下(10×20倍)分生孢子与菌丝形态；E.青霉属Penicillium sp.在显微镜下(10×10倍)分生孢子与菌丝形态；F.曲霉属Aspergillus sp.在显微镜下(10×10倍)分生孢子与孢子梗形态。图1 分离真菌菌落形态及显微形态

2.1.2种传真菌分子鉴定结果 未能通过形态鉴定的菌株通过ITS测序在美国国立生物技术信息中心(NCBI)比对序列鉴定菌株有曲霉Aspergillussp.、互隔交链孢霉Alternariaalternata、毛霉Mucorsp.、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、芽枝状枝孢霉Cladosporioides；种子内部携带尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum及互隔交链孢霉Alternariaalternata(见表1)。

表1 分离菌株ITS序列比对结果

2.2 甘草种子外部携带真菌种类

甘草种子外部带菌检测结果如表2所示，不同批次的甘草种子外部带菌量差异较大，在所检测的4批次中，批次A的外部带菌量最高，每粒种子的平均孢子负荷量为7.1个，且与其他批次差异显著。甘草种子外部主要携带的真菌有青霉属Penicilliumspp.、曲霉属Aspergillusspp.、链格孢属Alternariaspp.、芽枝状枝孢霉Cladosporiumcladosporioides、毛霉属Mucorspp.、立枯丝核菌R.solani等。其中，致病菌有立枯丝核菌R.solani和曲霉Aspergillus。

表2 甘草种子外部带菌检测结果

2.3 甘草种子内部携带真菌种类

甘草种子内部携带真菌检测结果如表3所示，不同批次的甘草种子内部带菌率差异有统计学意义。批次A的内部带菌率最高，为25%，与批次B和C差异有统计学意义，与批次D差异无统计学意义，甘草种子内部携带的真菌主要有青霉属Penicilliumspp.、曲霉属Aspergillusspp.、链格孢属Alternariaspp.和尖孢镰刀菌F.oxysporum。4个批次甘草种子均携带链格孢属Alternariaspp.，批次A和C带有青霉属Penicilliumspp.，批次D有曲霉属Aspergillusspp.。在批次A中还发现了尖孢镰刀菌F.oxysporum，其中致病菌有尖孢镰刀菌F.oxysporum和曲霉Aspergillus。

表3 甘草种子内部带菌检测结果 %

2.4 甘草种子外部带菌量与内部带菌率的相关性分析

甘草种子外部带菌量与内部带菌率相关性分析结果如图2所示，甘草种子外部带菌量与内部带菌率呈正相关关系，甘草种子外部带菌量越高，种子内部带菌率就越高；种子外部带菌量每升高1个/粒，种子内部带菌率就增加2.965%。此外，3个批次的种子外部、内部均分离得到链格孢属，分析发现种子外部链格孢属量和内部链格孢属带菌率具有类似相关性(见图3)，表明可通过种子外部带菌量可以推测种子内部带菌率情况。

图2 甘草种子外部带菌量与内部带菌率的相关性

图3 甘草种子外部与内部携带链格孢量的相关性

2.5 未处理和98%硫酸处理过的甘草种子发芽率比较结果

未处理和用98%硫酸处理过的甘草种子发芽率(见图4)。用98%硫酸处理过的比未处理的甘草种子发芽率高，说明98%硫酸可以帮助打破甘草的种皮机械障碍促进种子发芽。用98%硫酸处理的甘草种子批次A、B、C、D的发芽率分别为100%、88%、74%、54%；不做处理的甘草种子批次A、B、C、D的发芽率分别为46%、10%、12%、12%。经差异性分析得出4个批次的甘草种子经98%硫酸处理后的发芽率均显著高于未处理种子。

图4 未处理和98%硫酸处理过的甘草种子发芽率(n=400)

2.6 98%硫酸处理对甘草种子幼苗发病率的影响

未处理和用98%硫酸处理过的甘草种子幼苗发病率不同(见图5)，未处理的甘草种子幼苗发病率较高，其幼苗发病率分别为61%、11%、33%、40%；用98%硫酸处理大大降低了甘草种子幼苗的发病率，可以杀死其表面的部分真菌，其幼苗发病率分别是4%、0%、2.7%、7.1%。

图5 未处理和98%硫酸处理过的甘草幼苗发病率(n=400)

2.7 真菌致病性检测

将纯化的真菌菌株(曲霉、链格孢、毛霉、尖孢镰刀菌、芽枝状枝孢霉、立枯丝核菌)回接到健壮甘草幼苗茎基部上，9 d后发现回接尖孢镰刀菌、立枯丝核菌的甘草幼苗发生枯萎症状(见图6)，将发病幼苗病变部位用75%乙醇消毒后放在aPDA平板上，2 d后发现接种立枯丝核菌、尖孢镰刀菌的培养基上的菌落形态与所接种真菌的菌落形态一致。通过16 S ITS序列比对，确认分离菌株为接种菌株。通过接种试验确认了种传尖孢镰刀菌、立枯丝核菌可引起甘草幼苗病害。

注：A.无菌aPDA接种的对照植株；B.立枯丝核菌 Rhizoctonia solani接种植株；C.尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum接种植株；D.立枯丝核菌 Rhizoctonia solani菌落形态；E.尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum菌落形态。图6 甘草种子真菌致病性结果

3 结论与讨论

本研究对4个不同批次的甘草种子进行内外部携带真菌检测。结果表明，不同批次的种子带菌量与真菌种类均有差异。虽然4个批次甘草种子经过了相同的加工与存储过程，但是由于产自不同地区，种子的带菌情况受到发育过程不同环境影响而不同。据相关报道，甘草种子携带的真菌主要有曲霉菌、青霉菌、根霉菌和链格孢菌[11]。本研究发现甘草种子携带的真菌还包括芽枝状枝孢霉、毛霉属、立枯丝核菌和尖孢镰刀菌。甘草种子携带的真菌中链格孢菌所占的比例最高，同时进行了真菌致病性测定，经过接种幼苗后再分离发病植物组织，得到尖孢镰刀菌、立枯丝核菌为致病菌。为进一步确认甘草种子可携带的致病真菌，下一步研究可开展相同产区不同种子批次，不同年份收获种子批次带菌检测分析。

一般情况下，种子内部带菌检测采用次氯酸钠消毒，而后将种子摆放在培养基上培养[12]。本研究由于使用次氯酸钠消毒后种子培养时有大量细菌生长，干扰检测，因此采用了98%硫酸处理后的种子进行内部带菌检测，消除了细菌的干扰，其携带的真菌并没有被完全消灭，说明98%硫酸未能将甘草种子内部携带的真菌完全清除，在适宜的条件下也可用于种子外部消毒。

测定98%硫酸处理和未处理甘草种子的幼苗发芽率与发病率时发现，98%硫酸处理过的甘草幼苗发芽率显著升高且发病率显著降低，说明98%硫酸处理可以促进种子萌发并杀死甘草种子表面携带的部分真菌，降低甘草幼苗发病率。尤其是批次A的甘草种子用98%硫酸处理后发芽率达到100%，98%硫酸处理可使甘草种子种皮破损利于发芽[13]，发病率也显著降低，可以作为推荐甘草种子处理方式。

此外，本研究发现，甘草种子外部带菌量和内部带菌率存在正相关关系，可以通过甘草种子外部带菌量推测甘草种子内部带菌率。研究结果可以为甘草种子药剂处理预防种传病害提供基础数据。