磺化杯6芳烃对4类中药单体成分增溶作用及其机制研究△

李承浩，王萌，任晓亮*

1.天津中医药大学 中药学院，天津 301617；2.天津中医药大学 天津市现代中医药国家重点实验室，天津 301617

杯芳烃是一类由苯酚单元通过亚甲基桥在酚羟基邻位相连而得到的环状低聚物，由于其结构像一个酒杯，故被称为杯芳烃[1]。在其上缘进行结构修饰，得到磺化杯芳烃。磺化杯6芳烃(SC6A)具有合适的空腔(见图1)，其上缘的磺酸根增强了杯芳烃空腔的电负性，并为其提供了额外的静电结合位点，因此SC6A在水相中对有机阳离子展现出极强的键合能力[2-4]。此外，由于SC6A容易进行结构修饰，安全无毒，所以在药物研究中引起了广泛的兴趣[5]。部分中药单体成分水溶性较差，不仅影响其提取效果，而且会影响口服后的吸收利用度。因此改善中药单体成分的水溶性是中药研发的一大挑战。SC6A可以在水相中结合客体分子，从而达到增溶效果[6-7]。

图1 SC6A结构式

本实验采用高效液相色谱法(HPLC)研究SC6A对中药单体成分的增溶效果，采用荧光竞争滴定法测定键合常数并阐述其增溶机制，为SC6A在中药应用方向的研究提供参考。

1 材料

1.1 试药

荷叶碱(批号：141113)、槲皮素(批号：16062504)和芦丁(批号：14071231)均购于四川省维克奇生物科技有限公司；毒扁豆碱(批号：YN1103CA14)、奎宁(批号：Z26M8H36891)、乌头碱(批号：HA001001198)、次乌头碱(批号：HH001002198)、钩吻碱(批号：HA001001198)、吴茱萸碱(批号：X26A8P34704)、吴茱萸次碱(批号：C10J6Y1)、茶碱(批号：YN1103CA14)、苦参碱(批号：T22M10F88874)、野百合碱(批号：150921)、莨菪碱(批号：170821)、槟榔碱(批号：140311)、相思子碱(批号：151123)、士的宁(批号：140211)、橙皮苷(批号：140721)、大豆苷元(批号：141121)、大豆苷(批号：141211)、葛根素(批号：140921)、大黄酸(批号：EW410F88874)、大黄素(批号：D43210F88874)、大黄酚(批号：T22M10F88874)、绿原酸(批号：Y23M10K83669)、咖啡酸(批号：W01N9B73863)、原儿茶酸(批号：H21J9Z64031)、没食子酸(批号：C13O9C72105)均购于四川源叶生物科技有限公司，以上化合物纯度均大于98%；SC6A(批号：20181102，纯度≥98%)购于东京化成工业株式会社；罗丹明6G(RH6G)购于成都艾科达化学试剂有限公司；甲醇和乙腈购于美国Sigma公司；蒸馏水购于屈臣氏集团有限公司；三乙胺购于天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器

H2016D型台式高速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司)；BT125D型十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；FA2004A型万分之一电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；LC-20-AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Cary Eclipse型荧光光谱仪(美国安捷伦公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry®C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；生物碱类单体成分流动相：0.1%三乙胺水溶液(A)-乙腈(B)；黄酮类、蒽醌类、芳香性有机酸类单体成分流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)；流速1 mL·min-1；进样量10 μL。等度洗脱条件见表1。

表1 4类中药单体成分等度洗脱条件

2.2 SC6A对中药单体成分水溶解性的影响

2.2.1SC6A溶液制备 精确称定SC6A 223.42 mg，加40 mL水，配成5 mmol·L-1的SC6A储备液。

2.2.2供试品溶液制备 分别称取过量的荷叶碱、毒扁豆碱、奎宁、乌头碱、次乌头碱、钩吻碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、茶碱、苦参碱、野百合碱、莨菪碱、槟榔碱、相思子碱、士的宁、槲皮素、芦丁、橙皮苷、大豆苷元、大豆苷、葛根素、大黄酸、大黄素、大黄酚、绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸、没食子酸28个化合物各2份，分别加入1.0 mL蒸馏水和SC6A溶液，混匀。置于超声波清洗器中，超声30 min，8000 r·min-1离心10 min(离心半径12 cm)，咖啡酸、葛根素、苦参碱用甲醇稀释5倍，0.22 μm微孔滤膜滤过，即为供试品溶液[8-10]。

2.2.3样品测定 按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，HPLC分析，记录峰面积，未加入SC6A的各成分峰面积为A1，加入SC6A后各成分峰面积为A2，按照公式(1)计算峰面积增加倍数。

峰面积增加倍数=(A2-A1)/A1

(1)

2.3 荧光竞争法测定SC6A与生物碱类化合物的键合常数

2.3.1样品制备 磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)：取磷酸二氢钾1.36 g，加0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液79 mL，用水稀释至200 mL，即得。RH6G储备液：精密称取RH6G 0.48 mg，加PBS缓冲液1 mL溶解，即得。SC6A储备液：称取SC6A 2.50 mg，加PBS缓冲液1 mL溶解，即得。生物碱类化合物储备液：分别称取荷叶碱2.95 mg、乌头碱6.46 mg、次乌头碱6.32 mg、毒扁豆碱2.75 mg、野百合碱3.25 mg、苦参碱2.48 mg、钩吻碱3.22 mg、士的宁3.34 mg、相思豆碱2.18 mg、莨菪碱2.89 mg、茶碱1.80 mg、奎宁3.24 mg、槟榔碱2.36 mg，加PBS缓冲溶液1 mL，配成10 mmol·L-1的储备液。

2.3.2样品测定 用1 mmol·L-1的SC6A储备液与1 μmol·L-1的RH6G溶液，进行荧光光谱滴定。加1次补偿溶液得到1个荧光光谱，最终由于荧光淬灭效应，RH6G的荧光强度逐渐降低，从而得到一系列荧光光谱，用这些光谱作图，再取最大发射波长550 nm的荧光强度作图。用最小二乘法拟合公式进行拟合，得到SC6A和RH6G的键合常数[11-14]。

用9.8 mmol·L-1的荷叶碱补偿溶液与1 μmol·L-1的RH6G溶液和20 μmol·L-1的SC6A溶液，进行荧光光谱滴定。每加1次补偿溶液得到1个荧光光谱，最终由于荷叶碱与杯芳烃结合释放出染料分子，荧光池中RH6G的荧光强度逐渐升高，从而得到一系列荧光光谱，用这些光谱作图。取最大发射波长550 nm的荧光强度作图，通过公式拟合得到SC6A和荷叶碱的键合常数(Ks)。其余样品均用同法测定。

2.4 统计分析

3 结果与分析

3.1 SC6A对中药单体成分水溶解度的影响

采用HPLC法测定的28个中药单体成分加入SC6A溶液前后的样品峰面积，结果见表2。结果表明，除吴茱萸碱外，SC6A对生物碱类单体成分的水溶解性均具有显著影响；醌类化合物中大黄酸样品峰面积差异有统计学意义(P<0.05)；大部分黄酮类、蒽醌类和芳香性有机酸类单体成分峰面积差异无统计学意义。表明SC6A可显著降低大黄酸的溶解性，显著增加生物碱类单体成分的溶解性，对其他单体成分无显著性增溶作用[15-16]。

表2 SC6A对中药单体成分水溶解度的影响

续表2

3.2 直观分析

以未加入SC6A的28个成分的样品峰面积评分为1，以各成分加入SC6A后峰面积与加入前的比值作为增溶评分值，评分结果见表3。分值越高，说明SC6A对此成分的增溶效果越好。SC6A对15个生物碱类成分的增溶作用中，效果最好的成分是次乌头碱，增溶效果排序为次乌头碱>荷叶碱>乌头碱>吴茱萸次碱>奎宁>莨菪碱>士的宁>吴茱萸碱>苦参碱>野百合碱>相思子碱>钩吻碱>毒扁豆碱>茶碱>槟榔碱。SC6A对醌类、黄酮类、芳香性有机酸类12种成分增溶评分在1左右，无显著增溶作用。

表3 SC6A对28个中药单体成分的增溶评分

3.3 主成分分析(PCA)

PCA为双线性模型方法，是一种无监督的模式识别方法，其利用方差最大原则，对原始数据所包含的多个自变量进行线性拟合，以新的低维变量代替原始高维变量(即主成分)，各主成分之间互不相关，从而这些主成分能够反映原始变量的绝大部分信息，且所含的信息互不重叠，进而实现数据的降维[17-20]。本实验选取生物碱类(荷叶碱、乌头碱、次乌头碱)、黄酮类(槲皮素、芦丁、葛根素)、蒽醌类(大黄素、大黄酚、大黄酸)、芳香性有机酸类(咖啡酸、没食子酸、绿原酸)各3个成分，对加入SC6A前后水溶液中的峰面积进行综合PCA。再利用PCA分别描述黄酮类、蒽醌类、生物碱类及芳香性有机酸类成分的样本分布情况，结果见图2～3。

从图2中可明显看出分为4类：加入SC6A的生物碱类成分、加入与未加SC6A的黄酮类成分、加入与未加SC6A的有机酸类成分、加入与未加SC6A的蒽醌类成分和未加SC6A的生物碱类成分。生物碱类成分在加入SC6A前后明显聚为2类，而黄酮类、蒽醌类、芳香性有机酸类均没有此特征。说明SC6A仅对生物碱类成分表现出明显的增溶效果。

图2 SC6A对4类中药单体成分溶解度影响的总体PCA

图3中，生物碱类化合物加入与不加入SC6A的样本明显聚为2类，且分类界限明显；未加SC6A的样品分布在第二、三象限；加入SC6A的生物碱类样品分布在第一、四象限。而蒽醌类化合物也表现出明显聚为2类，但分布的象限与生物碱类相反。这应该是由于SC6A减小了大黄酸的溶解度造成的。黄酮类与芳香性有机酸类未表现出明显的聚类效果，说明其增溶效果一般。

图3 SC6A对中药单体成分溶解度影响的PCA

3.4 生物碱类成分与SC6A的Ks结果分析

如图4所示，选取RH6G为染料进行滴定，由于键合作用，SC6A包裹RH6G后荧光强度下降，从而得到一系列荧光光谱，拟合后得到SC6A和RH6G的Ks为(4.31±0.15)×104。采取竞争的方法测得13个生物碱与SC6A的Ks，见表4，滴定曲线见图5。结果表明，每个生物碱类化合物都与SC6A有键合作用，其大小顺序为次乌头碱>荷叶碱>士的宁>乌头碱>苦参碱>奎宁>莨菪碱>野百合碱>相思子碱>钩吻碱>毒扁豆碱>茶碱>槟榔碱。Ks>5×104的，增溶倍数都能达到10倍以上，超过1×105能达到50倍以上。

注：A.滴定曲线；B.直接滴定荧光图；图中曲线是随着客体浓度增大，荧光池中RH6G的荧光强度逐渐升高。图4 SC6A及13个生物碱类单体成分直接滴定荧光图及滴定曲线

表4 SC6A对生物碱类成分的

为了研究SC6A对生物碱类单体成分增溶作用与Ks的关系，本研究以实验条件下13个生物碱类成分与SC6A的Ks为横坐标，SC6A对其增溶倍数为纵坐标，绘制散点图，见图5。SC6A对13个生物碱类成分的增溶作用与Ks呈正相关趋势，即随Ks增大，SC6A对其增溶作用也增加。但也有个别成分偏离相关曲线，这应该是由于增溶效果除了与Ks相关，还与生物碱自身溶解性有关联。

图5 SC6A对13个生物碱类成分的增溶作用与Ks的关系

4 讨论

本实验采用HPLC分析SC6A对中药单体成分的增溶作用，采用SPSS分析、直观分析、PCA方法分析SC6A的增溶效果，采用荧光竞争滴定测定SC6A与生物碱类单体成分的键合常数，分析其与溶解度的关系。研究结果表明，SC6A对生物碱类单体表现出明显的增溶作用，这可能是由于SC6A上缘的磺酸根与生物碱类的氮原子具有较强的键合作用。其对黄酮类、蒽醌类、芳香性有机酸类均未展现出明显的增溶作用。而SC6A对大黄酸的溶解性有降低作用，可能是因为SC6A溶液呈酸性，抑制大黄酸中-COOH电离而使其溶解性变弱，但对芳香性有机酸类成分未显现出降低溶解度的作用。通过Ks的测定发现，大部分生物碱单体增溶效果与Ks呈现正相关，且与自身溶解度有关，客体成分自身溶解性较好的则增溶效果会降低。本实验总结出SC6A对中药单体成分的增溶规律与机制，以期为SC6A在中药应用方面的研究提供参考。