比较基因组杂交芯片在自然流产和胚胎停育病因诊断中的应用价值分析

蔺美娜 陈薪任 倪香 李欢 隋钰 赵宁 姜淼 卢永平

作者单位：110031 沈阳，辽宁省计划生育科学研究院 中国医科大学附属生殖医院 优生遗传科

自然流产和胚胎停育是临床上常见的异常妊娠结局，前者指妊娠不满28周、胎儿体重不足1 000 g，妊娠自行终止，发生率约为15%～25%[1]；后者指孕早期的胚胎死亡，超声检查孕囊内有形态不规则的胚芽或胎儿、无心管搏动，发生率约为20%[2]。自然流产和胚胎停育的产生原因十分复杂，包括遗传、免疫、感染、理化、环境、内分泌等，其中染色体异常是主要原因。核型分析技术是临床上染色体诊断的“金标准”，针对流产绒毛组织的核型分析，必须在无菌状态下获取绒毛组织，进行2～3周的细胞培养，但不能分辨＜5 MB的染色体变异，容易导致检测失败或漏诊[3]。比较基因组杂交芯片(Comparative Genomic Hybridization Array, aCGH)技术，可以在全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常(微缺失和微重复)，并能较准确地测定其大小，具有检测周期短(3 d)、分辨率高(可检测50 kb甚至更小的染色体变异)等优点。本研究通过对58例流产绒毛组织进行aCGH分析，探讨aCGH技术在流产原因探查中的可行性，分析早期流产和胚胎停育与染色体异常的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年5月—2019年5月在我院就诊的27例自然流产和31例胚胎停育患者，所有患者均行清宫术；年龄22～48岁，孕周7～16周；其中10例为辅助生殖技术治疗后怀孕者。纳入标准：①经阴道彩超检查提示胚胎停止发育；②患者具有流产史或胚胎停育史；③此次孕期均已排除支原体、衣原体、TORCH感染病史及其他病毒接触史；④无严重宫内疾病，无子宫肌瘤、子宫内膜异位症等影响胚胎着床因素；⑤无自身免疫性疾病；⑥男方无精子发育不良史；⑦患者签署知情同意书，同意采用aCGH技术对流产绒毛组织进行检测。

1.2 研究方法

1.2.1 标本处理及基因组D N A提取 清宫术获取绒毛组织，用无菌生理盐水冲洗2～3次，除去母血污染，取大约25 mg组织，用剪刀剪碎，通过QIAGEN Blood & Tissue试剂盒(德国QIAGEN公司)提取组织基因组DNA。使用NanoDrop 1 000紫外分光光度计和Qubit 3.0(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定DNA浓度。

1.2.2 aCGH芯片检测 使用Agilent公司8×60 K芯片进行检测，操作严格按照说明书进行，步骤如下：基因组DNA定量、片段化、荧光染料标记和纯化，67 ℃杂交24 h、洗涤，用Surescan芯片扫描仪扫描，利用CytoGenomics 3.0软件对原始数据进行分析。

1.2.3 aCGH芯片结果判读 参考常用国际公共数据库DGV、DECIPHER、ISCA、PubMed及相关文献报道等进行结果判读。根据染色体变异的性质，结果分为致病、可能致病、临床意义不明、可能良性、良性五类。

1.3 统计学方法 本研究对收集到的数据采用描述性统计分析，计数资料采用百分率表示。

2 结果

2.1 染色体异常类型分布 58例流产绒毛组织样品通过aCGH芯片进行检测，成功率100%，共有42例(72.41%)检出异常染色体，其中染色体数目异常26例、结构异常16例，见表1，各种染色体变异的典型举例见图1。

2.2 非整倍体异常检出情况 42例异常染色体中共检出26例(61.90%)染色体非整倍体异常，其中常染色体三体20例，双染色体三体、常染色体单体各3例。见表2。

2.3 染色体结构异常分布 42例异常染色体患者中共检出染色体结构异常16例(38.10%)，其中微重复2例、微缺失10例、微缺失+微重复2例、等臂染色体1例、等臂染色体+染色体单体1例。见表3。

3 讨论

染色体核型分析仍然是临床上遗传病诊断的“金标准”，但是对于流产绒毛组织的检测，首先需要临床医师在行清宫术时无菌取得绒毛组织，然后进行绒毛组织细胞培养。该法周期长，同时受细胞活力、细菌污染、培养条件、操作手法、母体细胞污染等因素的影响，绒毛细胞培养成功率不足80%[4]，而且核型分析通量低、耗时耗力、分辨率低，仅能发现＞5 MB的染色体异常，无法发现较小的致病性微缺失和微重复，导致很多病例无法得到准确结果，限制了核型分析在流产组织遗传学检测中的应用[5]。aCGH芯片是近年来兴起的染色体检测技术，可以在全基因组范围内检测出染色体异常，包括染色体非整倍体、微缺失、微重复等。

表1 42例流产绒毛组织异常染色体分布

图1 aCGH芯片检出典型染色体异常结果

表2 流产绒毛组织染色体非整倍体检出情况分布

本研究对58例流产绒毛组织进行aCGH芯片检测，实验成功率100%，检出染色体异常42例，其中染色体数目异常26例，是导致流产和胚胎停育的主要原因。本研究检出16三体最多，与Qu等[6]用SNParray法和Jia[7]用FISH法检测的早期流产染色体异常结果一致。研究显示[8-9]，在流产原因中16、21、22三体比较集中，本研究检出结果则集中在16、2、8三体，21、22三体检出率较低，差异的原因可能与纳入样本量、患者年龄、地域等差异有关。

双染色体三体指同一个核型中出现两种三体，是较少见的染色体异常。本研究检出3例双染色体三体，检出率为7.14%，高于Shearer等[10]的研究结果(采用核型分析双染色体检出率为3%，FISH双染色体检出率为0.5%)。FISH对双染色体三体检出率低，与探针的种类和对染色体非整倍的覆盖范围有关，该法不适用于染色体异常的筛查，更适合对已知结果的验证。

本研究共检出染色体结构异常1 6 例(38.10%)，高于以往的报道[11]，这可能与本研究样本量少、受检对象的选择及aCGH芯片灵敏度和分辨率高有关。本研究检出染色体微重复2例，分别出现在11号和18号染色体；检出微缺失10例，主要集中在2、7、12、19、22号染色体，这些染色体微缺失区域都含有与发育相关的重要基因，缺失后导致胎儿整体发育迟缓、智力障碍、心脏异常、额面部异常、心血管异常等，具有胚胎致死性，可能是导致流产及死胎的主要原因。本研究检出2例携带染色体微缺失+微重复，其中1例携带7q21.3～22.1微缺失合并11p13～15.1微重复，7q21.3～22.1微缺失区域含有AP1S1、SERPINE1、PLOD3等 72个OMIM基因，与身材矮小、全身发育迟缓等相关；11p13～15.1微重复区域包含ANO3、BDNF等43个OMIM基因，主要与脑病等有关。另1例为11p11.2微缺失合并11q24.3～25微重复，11p11.2微缺失区域包含ACP2、AGBL2、CKAP5等29个OMIM基因，与全身发育迟缓、肥厚性心脏病等有关；11q24.3～q25微重复区域包含IGSF9B、JAM3、VPS26B等10个OMIM基因，与全身发育迟缓、精神障碍、智力障碍、面部畸形、心脏畸形、中枢神经系统髓鞘形成迟滞等有关。上述结果提示，与早期流产和胚胎停育相关的染色体结构异常比较复杂，不仅涉及单一缺失或重复，还可以表现为多种异常结构的复合。

表3 流产物绒毛组织染色体结构异常分布

本研究不足之处：纳入样本量较少，统计结果与文献报道可能存在较大偏差；没有从流产/胚胎停育次数、孕妇年龄、是否为辅助生殖怀孕等方面进行分类统计和相关性分析；对aCGH芯片检出异常的绒毛组织，没有对其父母进行溯源验证，因此不能进行流产/死胎与父母的遗传学关系分析；除了公用数据库明确报道的致病性微重复和微缺失，其余不明确临床意义、可能良性、良性、不致病等检查结果均被纳入阴性结果；比较基因组芯片不能检测易位、倒位、突变的异常，可以通过与其他方法联合应用进行弥补；另外，对于未检出染色体异常的样本未做其他方面的分析。

综上所述，胚胎染色体异常是引起流产和胚胎停育的主要遗传学因素，流产绒毛遗传学检查不仅能够对胚胎停育进行病因学诊断，同时对患者的合理治疗和再生育的优生指导具有重要意义。aCGH芯片技术与传统的核型分析相比较，具有周期短、分辨率高、无需细胞培养，以及可以直接快速在全基因组范围内发现染色体数目异常和结构异常等优势，提高了染色体异常检出率，是进行流产物及死胎组织遗传学分析的有效手段，具有很高的临床应用价值。