消栓通络颗粒对动脉粥样硬化大鼠防治作用及机制研究

张然，夏彬，刘祖发，谢宇端，刘峰，张杰，赵巧，吴婉君

动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，可增加心肌梗死、脑卒中等疾病的发生率[1，2]，血管内皮损伤认为是AS启动的先兆[3，4]，氧化应激是AS的独立危险因素[5-7]。探索有效、安全的AS治疗药物具有重要的临床价值。中药因副作用小、作用靶点多、效果好而备受关注[8]。消栓通络颗粒由中风经典名方补阳还五汤化裁而来，功能益气活血，化瘀通络，但对于AS是否有治疗作用及可能的机制相关研究较少。本实验采用高脂饮食喂养和腹腔注射维生素D建立AS模型大鼠，通过检测血管组织中氧化应激水平及内皮保护相关因子水平变化，探讨消栓通络颗粒可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物SPF级SD大鼠，雄性，体重（220±10）g，40只，许可证号SCXK（京）2018-0006，由维通利华有限公司提供，饲养于上海中医药大学实验动物中心。

1.1.2 药品与试剂消栓通络颗粒由江苏平光信谊（焦作）中药有限公司提供；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号20180710）、丙二醛（MDA）测试盒（批号20180710）、一氧化氮（NO）测试盒（批号20180703）均购自于南京建成生物工程研究所；内皮素-1（ET-1）、血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（批号644701）购于R&D公司。

1.1.3 仪器SpectraMax 190全波长酶标仪（MD，美国）； Tissuelyser-24全自动样品快速研磨仪（上海净信科技，中国）；TBA-120型全自动生化检测仪（东芝，日本）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药按照随机双盲方法将动物分为4组：正常组、模型组、消栓通络低剂量[1.8 g/（kg·d）]组和消栓通络高剂量[7.2 g/（kg·d）]组，每组10只，正常组、模型组给予等量生理盐水。连续灌胃12周。

1.2.2 AS大鼠模型的构建正常组喂食基础饲料，其余3组喂食高脂饲料，即3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料。同时在喂食开始每2周性腹腔注射一次维生素D 60万IU /kg，对照组给予同等体积的生理盐水。在12周末次给药后，处死各组大鼠，取主动脉组织（主动脉弓至腹主动脉）。

1.2.3 组织MDA、 SOD、NO水平的测定取各组主动脉组织，清理凝血及结缔组织，混合生理盐水后磁珠震荡匀浆制成10%的组织匀浆，4000 rpm离心10 min取上清。首先通过BCA法定量各组织匀浆样本中总蛋白的含量（mg/ml），用于归一化以下各指标。依次按各试剂盒方法，测定显色反应的OD值。根据试剂盒建议的公式计算SOD活力和 MDA、NO 含量。

1.2.4 ET-1和VEGF水平的测定根据试剂盒推荐方法，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中内皮素-1（ET-1）和血管内皮生长因子（VEGF）。

1.3 统计学分析采用GraphPad Prism 7.00软件对数据进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，检验方差齐性后，采用单因素方差分析进行差异检验，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有显著统计学差异。

2 结果

2.1 一般情况观察实验过程中每天观察大鼠的一般状况，包括饮食、行为、毛发等，每周称量大鼠体重。各组大鼠未见明显异常，饮食、活动状态良好，粪便呈黑褐色块状，各组大鼠间摄食量均无明显差别。

2.2 各组大鼠氧化应激水平比较模型对照组大鼠组织中SOD活性下降（P＜0.01），MDA含量增加（P＜0.01）。经消栓通络颗粒治疗的实验大鼠血管组织中SOD略有升高但无统计学差异，过氧化物代谢产物MDA则明显减少，低剂量组（P＜0.05）与高剂量组（P＜0.01）均有统计学差异（表1）。

2.3 各组大鼠内皮保护相关因子水平比较模型对照组血管组织样本中ET-1的表达明显增加，消栓通络颗粒能够明显降低ET-1水平，高剂量组与模型对照组比较具有统计学差异（P＜0.05）。模型对照组血管组织样本中VEGF水平明显下降，消栓通络颗粒能够升高组织中VEGF水平，高剂量组与模型对照组比较具有统计学差异（P＜0.05）。模型对照组血管组织样本中NO略有上升，但与正常对照组无统计学差异，消栓通络组与模型对照组比较也无明显差异（表2）。

表1 血管组织氧化应激水平变化

表2 各组大鼠内皮保护相关因子变化

3 讨论

氧化应激存在于AS从脂纹病变到斑块破裂的整个发展过程中，介导了血管内皮细胞功能的改变及损伤[9]。MDA是脂质过氧化的终产物，浓度增加可加重对血管壁的损害，加速AS进程；SOD可清除氧自由基，是机体重要的抗氧化指标。ET-1具有强烈的缩血管作用，其水平与AS的严重程度呈明显正相关[10，11]；NO有舒张血管、抑制血小板聚集及在血管内皮黏附等多重作用，维持二者的动态平衡有助于保持内皮功能正常[12，13]。

消栓通络颗粒是传承清代名医王清任治疗中风经典名方补阳还五汤的方义，主要功效是益气活血，化瘀通络，由黄芪、川芎、丹参、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香等药物组成。石新涛等[14]研究显示，予消栓通络颗粒联合“靳三针”治疗，能进一步减轻痉挛性偏瘫患者的痉挛程度，改善神经缺损功能，提高运动活动能力和日常生活能力。张冉等[15]研究发现消栓通络方有效成分具有明显的抗血栓形成作用，可明显地延长试验组动物的血浆凝血酮时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT），可能对内源和外源性凝血途径具有抑制作用。但是，对于消栓通络颗粒抗动脉粥样硬化的作用机制研究仍然很少。

胡建芳等[16]观察参七脉心通胶囊对颈动脉硬化并高脂血症患者的血脂（LDL-C、TC等）、血清一氧化氮（NO）、血浆内皮素（ET）水平的影响，认为参七脉心通胶囊对高脂血症并颈动脉硬化患者的血管内皮功能有明显保护作用。本文结果显示，经低高剂量消栓通络颗粒干预后，MDA水平显著降低，表明消栓通络颗粒可以通过降低过氧化物代谢产物MDA而缓解局部病变，呈现出一定的量效关系。内皮保护因子方面，高剂量组大鼠的ET-1明显减少、VEGF含量显著升高，说明消栓通络颗粒可以通过对于ET-1和VEGF的调控保护血管内皮，但低剂量组与对照组相比，结果无显著性差异，其量效关系仍待进一步研究。此外，NO、SOD水平略有升高却无统计学差异，原因可能与试验组样本量小有关。综上所述，消栓通络颗粒对AS模型大鼠有较好防治作用，其机制可能与缓解组织氧化应激状态，减轻内皮损伤有关，期待从氧化应激、内皮损伤角度，进行进一步研究。