蜂蜜接合酵母及后发酵对黑糯米酒风味的影响

费永涛，姜弘佳，胡方正，彭立影，刘功良，白卫东，肖更生

蜂蜜接合酵母及后发酵对黑糯米酒风味的影响

费永涛1,2，姜弘佳1，胡方正1，彭立影1，刘功良1,2※，白卫东1,2，肖更生1

（1. 仲恺农业工程学院轻工食品学院，广州 510225；2. 现代农业工程创新研究院，广州 510225）

酿造菌种以及后发酵条件会影响黑糯米酒中风味物质的积累与产生，该研究利用气相色谱-质谱联用和液相色谱技术对黑糯米酒中氨基酸、有机酸和挥发性香味成分进行测定，探究酿造曲种（麦曲、蜂蜜结合酵母加麦曲和安琪酵母加麦曲）及后发酵条件（时间和温度）对黑糯米酒风味的影响，从而改善黑糯米酒的风味。研究结果表明蜂蜜接合酵母加麦曲制备的黑糯米酒可以将乳酸占比控制在20%左右，避免乳酸的过量积累，同时显著提高苹果酸（2.5 mg/mL）和琥珀酸（1.1 mg/mL）含量（0.05），赋予酒体整体的协调性。蜂蜜接合酵母加麦曲样品制备黑糯米酒中氨基酸（以甜味和鲜味氨基酸为主）的总量为113 mg/L，要高于麦曲制备的黑糯米酒中氨基酸的含量（0.05）。此外，该研究发现醛类物质是黑糯米酒中的主要挥发性风味物质，其中糠醛在安琪酵母加麦曲和蜂蜜接合酵母加麦曲黑糯米酒中相对含量分别达到9.11%和10.00%，高于麦曲黑糯米酒中5.83%的糠醛含量（0.05），因此，蜂蜜接合酵母加麦曲作为酿造曲种更能改善黑糯米酒风味。利用最佳的酿造曲种组合，对黑糯米酒的后发酵时间（0，20，30，40，50 d）和温度（20，24，28℃）进行优化，研究发现，酒中氨基酸总量在后发酵30 d达到1 024 mg/L，但后发酵40 d酒中苦味氨基酸迅速减少，同时有机酸种类和含量更为协调，并且挥发性香气成分中醇、酯和醛类相对含量达到85.7%，因此，后发酵40 d有利于黑糯米酒风味的形成。相比20 ℃的后发酵温度，在24 ℃条件下，黑糯米酒中氨基酸种类和含量快速增加，分别达到13种和383 mg/L，并且醇、酯和醛类等主要风味物质相对含量较高，24 ℃的后酵温度有利于必须氨基酸和主要挥发性风味物质的积累。研究结果为蜂蜜接合酵母的应用及黑糯米酒风味提升提供借鉴。

发酵；风味；温度；蜂蜜接合酵母；酒曲；黑糯米酒

0 引 言

黑糯米中含有丰富的氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质以及酚类等物质[1]，具有滋阴补肾、健脾暖胃、抵抗衰老、强身健体等功效[2-3]。以黑糯米为主要原料酿造的黑糯米酒同样含有人体所需的丰富营养成分，具有馥郁芬芳的黑糯米香气，滋味醇厚协调，风格独特[4-7]。微生物发酵是制备黑糯米酒过程中最重要的环节，酒的口感与风味在很大程度上会受酒曲中的微生物的种类及代谢产物影响，因此酒曲的选择以及酿造菌种的添加对酒的品质具有重要的影响[8-10]。大量研究发现多种菌株混合酿造的酒所产生的风味物质成分比单一菌种更丰富[11-14]。苏伟等[15]对贵州不同地区黑糯米酒曲的品质进行分析比较，发现不同曲种酿造的黑糯米酒，酒的风味和营养成分有显著差别（<0.05）。同时，发酵条件如温度、时间和原料等对酒的风味也有显著的影响[16-17]。母应春等[17]利用新基质原料（如枸杞、山药、覆盆子等）制作黑糯米酒的酒曲，发现不同酿造温度和时间酿造微生物菌群结构和酶促反应速率有显著的差别（0.05），进而会影响黑糯米酒的风味。此外，有机酸种类和含量对酒的风味也有显著的影响（0.05），同时有机酸也是酒体酯类物质重要的前体物质之一[18]。氨基酸的组成也会对酒体风味有显著的影响，例如苦味与涩味氨基酸大量积累会给米酒带来苦涩的味道，同时鲜味与甜味氨基酸也会给酒体带来鲜甜味[19-20]。前人针对提升黑糯米酒风味的研究主要集中在酒曲的筛选、酒曲原料的改进以及酿造条件的优化方面[15-17]，而通过在酒曲中添加酿造菌种来改善黑糯米酒风味的研究鲜有报道。

本文以麦曲、麦曲协同蜂蜜接合酵母及麦曲协同安琪酵母3种曲种组合方式分别酿造黑糯米酒，探讨酿造曲种对黑糯米酒中的有机酸、氨基酸含量及香气成分等风味物质的影响。在此基础上，研究后发酵条件对麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒品质的影响，拟为黑糯米酒的工艺研究提供理论基础及参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麦曲：广东紫金黄龙酒业有限公司；蜂蜜接合酵母LGL-1：仲恺农业工程学院实验室筛选出的耐高糖酵母菌株，保存于中国典型物保藏中心，编号为M2015545；安琪酵母（黄酒高活性干酵母）：安琪酵母股份有限公司；黑糯米：贵州永红酒业有限公司。

蜂蜜接合酵母培养基配方：70.0 g葡萄糖、2.0 g琼脂粉、2.0 g蛋白胨、1.0 g酵母提取粉，100 mL去离子水。甲醇、乙腈、邻苯二甲醛（O-Phthalaldehyde，OPA）、硼酸盐缓冲液、氨基酸标准品等试剂均为色谱纯；酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、琥珀酸、磷酸、磷酸氢二铵、氯化钠、磷酸二氢钠，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZX-30FBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DHP-9602恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津津腾实验设备有限公司；KQ5200V超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；6890N质谱仪、5973气相色谱仪、1260液相色谱仪：安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化、扩培

酵母菌的活化扩培方法参考课题组前期报道[21]，从-80 ℃冰箱取出保藏的蜂蜜接合酵母LGL-1，28 ℃培养箱中放置30 min。制备葡萄糖质量浓度为700 g/L的试管斜面固体培养基，高温灭菌后，待培养基凝固，挑取一环蜂蜜接合酵母LGL-1在培养基斜面划线培养96 h，至出现菌落。安琪酵母的活化方法同蜂蜜接合酵母LGL-1，培养基中葡萄糖质量浓度为100 g/L。

扩大培样：挑取两环活化的蜂蜜接合酵母LGL-1菌株于10 mL葡萄糖质量浓度为300 g/L的培养液中，将安琪酵母接种到葡萄糖质量浓度为100 g/L的培养基中，28 ℃、180 r/min恒温摇床培养48 h后，将10 mL发酵液倒入90 mL葡萄糖质量浓度为 300 g/L的培养液中，28 ℃、180 r/min 恒温摇床继续培养48 h，即成接种液，经平板稀释检测法测定，接种液的活菌数量为1.5×109个/mL。

1.3.2 黑糯米酒制备工艺

黑糯米酒的发酵分为前发酵和后发酵，前发酵流程如图1所示，选取没有霉变，品质均一的黑糯米，用水冲洗3遍，然后将洗干净的黑糯米进行浸泡处理，液面覆盖米粒，在室温（25 ℃）下浸泡24 h；对浸泡过的黑糯米进行蒸煮，干净的纱布将浸泡好的黑糯米包好，置于高压灭菌锅内，121 ℃蒸煮20 min，蒸完的米粒应该无夹生、有弹性但不粘手，达到熟而不烂，将蒸好的米饭摊开到滤布上，室温冷却至30 ℃左右；按1.0%的比例将麦曲加入淋凉好的米饭中，充分搅拌均匀，装入发酵容器内，稍压实以防塌窝，搭窝并用保鲜膜封口后放入生化培养箱，进行糖化，时间为36 h。将上述活化的酵母菌液，按10%的比例分别加入到糖化液中，同时将未添加酵母菌种空白对照，在28 ℃下发酵6 d，前发酵结束后将黑糯米酒放置在24 ℃培养箱中分别进行后发酵。

1.3.3 后发酵条件对黑糯米酒风味的影响

探究蜂蜜接合酵母LGL-1和安琪酵母对黑糯米酒品质的影响，将前文活化的蜂蜜接合酵母LGL-1和安琪酵母菌液，按10%的比例分别加入到由麦曲作为菌种发酵制备的糖化液中，同时将未添加酵母菌种作为空白对照，在28 ℃下发酵6 d，前发酵结束后将黑糯米酒放置在24 ℃培养箱中分别进行后发酵，时间为40 d，测定黑糯米酒中有机酸、氨基酸以及挥发性风味成分。

图1 黑糯米酒生产工艺流程

此外，研究后发酵时间及温度对黑糯米品质的影响，将麦曲协同蜂蜜接合酵母LGL-1对黑糯米进行前发酵，结束后将前发酵得到的黑糯米酒置于24 ℃培养箱中分别进行20、30、40、50 d后发酵试验，测定黑糯米酒中有机酸、氨基酸以及挥发性风味成分；将麦曲协同蜂蜜接合酵母LGL-1对黑糯米进行前发酵，结束后将前发酵得到的黑糯米酒置于20、24、28 ℃培养箱中进行40 d后发酵试验，测定黑糯米酒中有机酸、氨基酸以及挥发性风味成分。

1.3.4 黑糯米酒中有机酸的测定

利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）对中黑糯米酒中的有机酸含量进行测定，参考国标GB 5009.157—2016[22]。吸取5 mL黑糯米酒样在6 000 r/min条件下离心5 min，将上清液经0.22m有机滤膜过滤后，超声波除气10 min，备用。

色谱条件：色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6 mm×250 mm，5m；流速：0.9 mL/min；检测波长：213 nm；柱温：30 ℃；流动相配比：0.01 mol/L磷酸氢二铵（pH值3.0）溶液与甲醇的体积比为2∶98。

有机酸标准曲线的绘制：称取酒石酸1600 mg，苹果酸400 mg，乳酸387.2 mg，乙酸504 mg，柠檬酸200 mg，琥珀酸480 mg，用超纯水定容至100 mL。根据样品中有机酸含量分别稀释，经0.22m有机滤膜过滤进样。以有机酸浓度为值，同一样品检测10次浓度的标准偏差为值，计算回归方程和决定系数，其中酒石酸：1=139.61+4.14（2=1.000 0），苹果酸：2=168.922+2.49（2=1.000 0）乳酸：3=83.1643+5.91（2=0.999 9），乙酸：4=115.54+17.29（2=0.999 7），柠檬酸：5=109.435+8.39（2=0.999 9），琥珀酸：6=169.876-4.45（2=0.997 9）。将酒样与有机酸标准品以8∶2的体积比混合，分别测定酒样、有机酸标准品和混合样品的有机酸含量，试验重复3次。

1.3.5 黑糯米酒中氨基酸的测定

黑糯米酒中氨基酸的测定方法参考陈林等[23]报道，略有改动。使用OPA试剂对离心得到的发酵上清液进行在线衍生化。

色谱条件：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse AAA氨基酸分析柱，4.6 mm×150 mm，5m，柱温值35 ℃，流动相A为0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液（pH值7.8），流动相B为甲醇+乙腈+水（体积比为45∶45∶10）。

标准曲线的绘制：分别以1、3、5、7、9L进样量吸取氨基酸标准品，以进样量为值，峰面积为值计算回归方程和相关系数，其中天冬氨酸：1=143.391+ 4.24（2=0.999 5），谷氨酸：2=151.952+9.78（2=0.999 8），丝氨酸：3=190.033+1.29（2=0.999 9），组氨酸：4=74.734+5.17（2=0.952 5），甘氨酸：5= 162.735+0.24（2=0.996 2），苏氨酸6=163.116+8.04（2=0.997 3）精氨酸：7=177.447+2.00（2=0.999 9），丙氨酸：8=201.288+6.61（2=0.999 8），酪氨酸：9=167.649+2.54（2=0.9933），半胱氨酸：10=281.2210+1.22（2=0.9998），缬氨酸：11=138.3611+5.15（2=0.9999），蛋氨酸：12=240.7412+1.56(2=0.999 9)，苯丙氨酸：13=111.3213+1.04(2=0.999 9)，异亮氨酸：14=223.0514+3.39(2=0.999 8)，亮氨酸：15=142.0115+8.65(2=0.995 8)，赖氨酸：16=385.8816-5.80(2=0.999 6)。将酒样与氨基酸标准品以100∶1的体积比混合，分别测定酒样、氨基酸标准品和混合样品的氨基酸含量。

1.3.6 黑糯米酒中挥发性香气成分的测定

利用气相色谱-质谱联用技术对黑糯米酒中的挥发性物质进行测定，具体方法参考已报道文献[24]，略有修改。

样品预处理：取8 mL酒样于15 mL顶空瓶中，加入2 g氯化钠和转子，置于40 ℃恒温磁力搅拌器中，将老化过的萃取头插入萃取瓶，顶空萃取40 min。萃取完成后先收回萃取头再拔出针头，采取手动进样方式将针头插入质谱进样口，开始程序后立即推出萃取头，解吸5 min后收回萃取头，拔出针头。

色谱条件：色谱柱DB-5(30 mm×0.25 mm，0.25m)；进样口温度250 ℃；升温程序：35 ℃保持3 min，以每分钟10 ℃升至110 ℃，保持3 min，再以每分钟5 ℃升至150 ℃，保持2 min，最后以每分钟7 ℃升至230 ℃，保持6 min；载气：He；流速：1 mL/min；压力53.5 kPa，进样量1L；不分流。

质谱条件：电子能量：70 eV；离子源温度230 ℃；采集模式：全扫描；四级杆温度：150 ℃。

定性定量分析：使用Proteo Wizard软件将质谱原始数据进行转换，同时利用XCMS做保留时间矫正、峰识别、峰积分等工作。使用OSI-SMMS软件配合数据库进行物质鉴定。采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。

1.3.7 数据处理与统计方法

试验结果以平均值±标准差（χ±SD）表示，采用Origin 9.0进行处理，采用统计软件 SPSS 22.0 进行ANOVA 分析，0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 有机酸和氨基酸的测定

黑糯米酒中主要存在酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸这6种有机酸，本研究采用HPLC的方法成功检测出黑糯米酒中的6种有机酸，测定结果如图2所示。

注：苹果酸3.593 min，乳酸4.297 min，乙酸4.546 min，柠檬酸5.300 min，琥珀酸6.171 min。

在黑糯米酒发酵过程中，微生物分泌蛋白酶将黑糯米中的蛋白质水解成氨基酸，本研究采用HPLC的方法成功检测出黑糯米酒中的16种氨基酸的相对含量，测定结果如图3所示。

注：天冬氨酸1.526 min，谷氨酸3.109 min，丝氨酸5.937 min，甘氨酸7.107 min，苏氨酸7.494 min，精氨酸8.109 min，苯丙氨酸8.439 min，酪氨酸9.618 min，缬氨酸11.318 min，蛋氨酸11.507 min，苯丙氨酸12.683 min，异亮氨酸12.805 min，亮氨酸13.134 min，赖氨酸13.826 min。

2.2 酿造曲种对黑糯米酒风味的影响

2.2.1 酿造曲种对黑糯米酒有机酸和氨基酸的影响

有机酸作为酒中重要的香气物质之一，不仅可以丰富酒的口感及香气，同时可以抑制杂菌的生长[25-26]。本文对不同酿造曲种黑糯米酒中有机酸含量进行了测定，如图4所示，在3组黑糯米酒中，柠檬酸、苹果酸、乳酸和乙酸是黑糯米酒中主要的有机酸，与前期报道的糯米酒中有机酸的种类一致[26]。以麦曲酿造黑糯米酒中有机酸的总量为13.5 mg/L，可以检测到5种有机酸，其中乳酸含量最高，占比达到63%；麦曲结合安琪酵母酿造的黑糯米酒中有机酸的总量为11.6 mg/L，乳酸占比也达到57%；以麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒有机酸总量为8.7 mg/L，而乳酸占比只有20%左右，适量的酸类物质可以提高酒的整体协调性，酸过高会使酒的口感粗糙，且会压制酯类物质的香气，酸过低不利于酒体呈香[27]。此外，麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒中，可以检测到6种有机酸并且各种有机酸含量分布较为均匀，黑糯米酒的口感更为协调，同时苹果酸的含量为2.5 mg/mL，显著高于其他两组（1.9 mg/L）（0.05），苹果酸接近天然苹果的酸味，具有味道柔和，滞留时间长等特点，赋予酒体特殊的香味[28]。麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒中可以检测到琥珀酸，含量为1.1 mg/L，主要由蜂蜜接合酵母的三羧酸循环产生，琥珀酸能调和酒体，增加酒的醇厚感[29]。因此，蜂蜜接合酵母在发酵过程中可降低乳酸的过多积累，适宜浓度的乳酸在酿造过程中不仅能降低pH值促进糖化，还可提高苹果酸和琥珀酸含量，赋予酒体整体的协调性。

注：不同字母表示同类有机酸和氨基酸含量差异显著（P<0.05）。

黑糯米酒含有人体所需的丰富营养成分，氨基酸是最重要的营养成分之一[6]，本研究针对不同曲种发酵制备的黑糯米酒中氨基酸含量进行研究，结果如图4所示，在前酵阶段添加酵母菌种的两组黑糯米酒中氨基酸的总量分别为152 mg/L和113 mg/L，显著高于未添加酵母的黑糯米酒中的氨基酸总量（57 mg/L）（<0.05），主要由于额外添加的酵母菌能够分泌蛋白酶、肽酶等将酒醪中的蛋白质进一步降解为多种氨基酸，提高黑糯米酒中氨基酸的含量[30]。苏伟等[31]利用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱联用（UPLC-QE-MS）法也在黑糯米酒中检测到大量氨基酸，如亮氨酸、赖氨酸和甘氨酸等，提高了黑糯米酒的营养和风味。以麦曲协同安琪酵母酿造的黑糯米酒中氨基酸种类最多，含7种氨基酸，且精氨酸、组氨酸和异亮氨酸等苦味氨基酸所占比重最大，精氨酸的浓度超过10 mg/L，精氨酸作为重要的苦味氨基酸[32]，大量存在酒体中会给酒带来苦涩的味道；以麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒中有6种氨基酸，浓度适中，均匀协调，精氨酸的浓度大幅下降。由此可见，在黑糯米酒酿造过程中额外添加酵母，能不同程度丰富酒中氨基酸种类，提高氨基酸含量。

2.2.2 酿造曲种对黑糯米酒香气成分的影响

本研究对黑糯米酒中的风味物质进行测定，结果如表1所示。以麦曲酿造的黑糯米酒中检测到29种香气成分，其中醇类7种，占12.78%，酯类3种，占4.94%，醛类4种，占29.23%，酮类8种，占13.44%，挥发性酸类4种，占14.36%，酚类2种，占5.72%。苏伟等[33]利用电子舌结合GC/MS分析黑糯米酒中的风味物质，共检测到50种香气成分，其中醇类8种，酯类11种，醛类4种，烷烃类20种，酮类1种，酸类2种，酚类3种，与本研究的风味物质检测结果差异较大，尤其是在烷烃类、醛类以及酯类方面，主要由于使用的种曲以及工艺不同导致的，该研究还发现黑糯米酒中主要风味物质为2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、丙三醇、苯乙醇，而这些风味物质在本研究中都检测到，这些醇类的风味物质是黑糯米酒共性的风味物质。以麦曲协同安琪酵母酿造的黑糯米酒中检测到30种香气成分，其中醇类6种，占12.20%，酯类4种，占4.71%，醛类5种，占32.96%，酮类7种，占15.29%，酸类3种，占6.3%，酚类2种，占4.35%；以麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒中检测到31种香气成分，醇类6种，占14.51%，酯类3种，占4.33%，醛类5种，占34.91%，酮类8种，占17.18%，酸类5种，7.67%，酚类2种，占4.64%。相对麦曲酿造的黑糯米酒中挥发性有机酸的含量（14.36%），添加酵母菌种的两组挥发性有机酸的含量明显减少，分别为6.30%和6.19%，与前面有机酸含量测定结果基本一致。在不同曲种酿造的黑糯米酒中，醛类物质的相对含量高于醇类、酯类和酮类等挥发性风味物质，占比在30%左右，其中以麦曲协同安琪酵母和麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造黑糯米酒中的糠醛相对含量分别9.11%和10.00%，约为以麦曲酿造黑糯米酒的2倍。研究表明糠醛在酱香型白酒中含量最高，并且酱香、糊香、焦香和曲香与糠醛具有较好的相关性[34]。综上所述，麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒在有机酸、氨基酸和挥发性香气成分方面比麦曲协同安琪酵母酿造的黑糯米酒更有优势，后续将以麦曲和蜂蜜接合酵母组合作为酿造曲种，探究后发酵时间和温度对黑糯米酒中有机酸、氨基酸以及风味成分的影响。

表1 不同曲种酿造的黑糯米酒中香气成分

注：-表示未检出。小写字母表示同一物质不同处理间差异显著（0.05）。

Note: “-” means the aroma ingredients was undetected. The lowercase letters indicate the significant difference between different groups (0.05).

2.3 后发酵对黑糯米酒风味物质的影响

2.3.1 后发酵时间对黑糯米酒风味物质的影响

后发酵对酒的风味及口感起到重要作用，在这个过程中微生物的代谢活动仍在进行[35]，发酵时间对酒体中有机酸、氨基酸以及挥发性风味物质有重要的影响。本研究对不同后发酵时间黑糯米酒中有机酸、氨基酸及挥发性风味物质的含量进行测定，如图5所示。在后发酵过程中，黑糯米酒的有机酸总酸质量浓度从初始的9.2 mg/L增加到第30天的20.8 mg/L，后酵期间是有机酸积累的重要阶段，有利于风味的形成。在测定的有机酸中，琥珀酸在后酵阶段含量变化明显，从开始的1.6 mg/L增加到30天的15.7 mg/L，在第40天降到了4.1 mg/L，而琥珀酸并未在麦曲以及麦曲协同安琪酵母酿造的黑糯米酒检测到，同时在已报道的黑糯米酒中也未发现琥珀酸大量的存在[5,6,17]，因此琥珀酸可能主要由蜂蜜接合酵母代谢产生。此外，在后酵期间，乳酸含量的变化也较为显著，从初始的1.8 mg/L增加到40 d的8.0 mg/L（0.05），有研究报道发现，麦曲中还有大量的乳杆菌属，是米酒酿造过程中的优势菌群之一[36]，在后酵阶段，该菌属会代谢产生大量的乳酸并不断积累，对黑糯米酒的风味形成起了重要的作用。后酵期间有机酸的组成以琥珀酸为主，然后乳酸、乙酸和苹果酸不断积累，琥珀酸迅速减少，到40 d后变为多种有机酸协调存在，使黑糯米酒的口感更加协调。

在后发酵0～20 d时，黑糯米酒中的氨基酸种类由6种增加到14种，同时总含量由初始的79 mg/L迅速增加到30 d的1 024 mg/L（0.05），含量增加较为显著的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸（<0.05），如图5b所示，主要由于后酵前期微生物菌群分泌大量蛋白酶类，醪液中蛋白质被水解为氨基酸[30]。在后发酵20～50 d黑糯米酒中各种氨基酸的种类基本保持不变，但是到后发酵第40天时，黑糯米酒中各种氨基酸总含量显著降低，甜味氨基酸和苦味氨基酸含量都在明显降低（<0.05），其中呈苦味精氨酸未被检测到，主要由于后酵后期微生物菌群在不断进行新陈代谢，大量氨基酸被消耗掉。研究人员也发现不同后发酵时间黑糯米酒中氨基酸的含量存在显著的差异，如半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代和异亮氨酸等[37]。

由图5c可知，黑糯米酒在后发酵期间，醛类物质是黑糯米酒中挥发性成分相对含量最高的，它们的相对含量在后酵第40天达到最大值55.8%，此外，醇类的相对含量由后发酵初始值14.1%增加到第40天的22.5%，同时酯类物质也由4.3%增加到7.4%，这三种主要的挥发性风味成分含量达到85.7%。而酮类、酸类和酚类物质则变化不明显（>0.05）。因此，后发酵时间为40 d更有利于酒中醇类、酯类、醛类等风味成分的积累。从有机酸、氨基酸和挥发性香味物质综合评价，后酵40 d更有利于黑糯米酒风味物质的形成。

2.3.2 后发酵温度对黑糯米酒中风味物质的影响

本研究对不同发酵温度下黑糯米酒中有机酸、氨基酸及挥发性风味物质的含量进行测定，如图6所示。随着后发酵温度的升高，黑糯米酒中有机酸总含量逐渐增加，从20℃下的9.8 mg/L提高到24℃的17.8 mg/L，而从24℃到28 ℃，有机酸总量增加不明显（>0.05）。在测定的5种有机酸中，乳酸和琥珀酸含量明显升高（<0.05），而柠檬酸随着后发酵温度的升高含量逐渐降低，由1.1 mg/L降低到0.3 mg/L，降低后发酵温度有助于适当提高酒体中柠檬酸的含量，柠檬酸是微生物的三羧酸（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA）循环中间产物，且会被黑糯米酒发酵过程中的微生物利用进入TCA循环并转化，因此柠檬酸含量相对较低。相比其他温度，28 ℃更有利于霉菌、酵母和细菌的生长，代谢速率加快，TCA循环加快，柠檬酸含量降低明显。

注：发酵温度为24 ℃，不同字母表示有机酸、氨基酸和风味成分含量差异显著（P<0.05）。

注：后发酵时间为40 d。不同字母表示有机酸、氨基酸和风味成分含量差异显著（P<0.05）。

由图6b可知，后发酵温度为20 ℃，黑糯米酒的氨基酸含量相对较低，总量为229 mg/L，只检测到8种氨基酸；在24 ℃的环境中氨基酸总含量增加显著（<0.05），总量达到了383 mg/L，且氨基酸种类增加了5种，分别是蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸，达到13种；在28 ℃的温度下，氨基酸总量和种类与24 ℃对比而言相对稳定。研究表明，酵母自溶可释放出蛋白酶A、多肽及氨基酸，分解醪液中的蛋白质，使得醪液中的氨基酸含量上升[38]，温度对酵母自溶速度有很大的影响，温度越高，酵母自溶速度加快[31]。因此，后发酵温度过低不利于酒中氨基酸的产生与积累。

后发酵过程中，适当的低温条件有利于促进酒液中的有机酸与醇继续发生酯化反应生成乙酸乙酯、乳酸乙酯、甲酸乙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯等各种酯类，对丰富酒体品质有重要的作用[31]。由图6d可知，当后发酵温度由20 ℃升温至28 ℃，黑糯米酒中醇类、酯类、醛类、酮类与酚类物质所占比例均呈现先升高后降低的趋势，且在24 ℃时这5种香气成分所占比例均达到最高。因此，后发酵温度为24 ℃时有利于酒中醇类、酯类、醛类、酮类、酚类物质的积累。

3 结 论

本研究分别以麦曲、麦曲协同蜂蜜接合酵母以及麦曲协同安琪酵母3种曲种组合方式酿造黑糯米酒，分析不同曲种组合对酒中风味物质的影响，研究了不同后发酵时间和后发酵温度对以麦曲协同蜂蜜接合酵母酿造的黑糯米酒品质的影响。得到以下结论：

1）蜂蜜接合酵母组合在发酵过程中可维持有机酸的均衡，赋予酒体整体的协调性，可以提高酒体中氨基酸含量，避免苦味氨基酸的过量积累，促使糠醛的产生，提高黑糯米酒的酱香和曲香。

2）蜂蜜接合酵母组合后发酵30 d的酒体中有机酸以琥珀酸为主，后酵40 d酒体多种有机酸协调存在，氨基酸含量在40 d后含量维持相对稳定并有利于酒中醇类、酯类、醛类等风味成分的积累。后酵40 d更有利于黑糯米酒风味物质的形成。

3）蜂蜜接合酵母组合后发酵20 ℃的酒体中氨基酸含量较低，检测到8种氨基酸，在24 ℃下酒体中氨基酸总含量及种类显著增加（<0.05），同时黑糯米酒中醇类、酯类、醛类、酮类与酚类物质所占比例均达到最高。因此，24 ℃的后发酵温度能够促进黑糯米酒中风味物质的形成。

综上所述以蜂蜜接合酵母加麦曲作为酿造曲种，在24 ℃下后发酵40 d，有利于黑糯米酒风味物质的形成，但是风味物质形成与曲种之间关系尚不明确，同时由于蜂蜜结合酵母的产酒率不高，需要开展诱变育种相关的工作来提高该菌的产酒率。

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Effects ofand post-fermentation on the flavor of black glutinous rice wine

Fei Yongtao1,2, Jiang Hongjia1, Hu Fangzheng1, Peng Liying1, Liu Gongliang1,2※, Bai Weidong1,2, Xiao Gengsheng1

(1.,510225,; 2.,510225,)

Flavor of black glutinous rice wine depends significantly on starter cultures and the post-fermentation conditions. In this study, a systematic investigation was made to explore the effects of brewing koji (wheat koji, wheat koji+angie yeast and wheat koji+) and post-fermentation(time and temperature) on the flavor of black glutinous rice wine, where the amino acids, organic acids, and volatile aroma components were determined using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and high performance liquid chromatography (HPLC). Angie yeast andwere added to the wheat koji for co-fermentation. The lactic acid of black glutinous rice wine that prepared byand wheat koji accounted for 20% of the total organic acid, lower than that prepared by wheat koji and its combination with angie yeast（0.05）.was found to inhibit the excessive accumulation of lactic acid, while to increase content of malic acid (2.5 mg/mL) and succinic acid (1.1 mg/mL) （0.05）, bringing the overall compatible flavors to the black glutinous wine. Meanwhile, the content of amino acids was 113 mg/L in the black glutinous rice wine prepared bywith wheat koji, which was significantly higher than that prepared by wheat koji. In addition, it was found that aldehydes were the main volatile flavor substances in black glutinous rice wines that prepared by three different starter cultures. The relative contents of furfuraldehyde were 9.11 % and 10.00 % in black glutinous rice wine that prepared by angie yeast andstarters, respectively, twice as much as that prepared by wheat koji（0.05）. Therefore, the flavors of black glutinous rice wine that prepared bystarter group was better than that prepared by other two groups.combined with wheat koji was used to produce black glutinous rice wine, in order to further investigate the effects of post-fermentation time and temperature on the flavor of black glutinous rice wine. After 30 days of post-fermentation, the content of amino acids was highest with 1073 mg/mL in the wine, and the content decreased and kept stable at 40 days of fermentation. Meanwhile, it was found that the bitter amino acids in the wine rapidly decreased at 40 days of fermentation. Besides, the varieties and contents of organic acids in the wine were more coordinated, and the relative contents of alcohols, esters and aldehydes in the volatile aroma components were the highest (85.7%). Therefore, the flavor of black glutinous rice wine was best at 40 days of fermentation. When the post-fermentation temperature was 20 ℃, the content of amino acids was 229 mg/L with only 8 kinds of amino acids. At 24 ℃, the total content of amino acids reached 383 mg/L and the varieties of amino acids increased to 13. The relative content of esters and aldehydes reached the highest in the black glutinous rice wine at this temperature. The post-fermentation temperature of 24 ℃ was favorable for the accumulation of amino acids and main volatile flavor substances. Therefore, this finding can provide a sound reference to improve the flavor of black glutinous rice wine using

fermentation; flavor; temperature;; koji; black glutinous rice wine

费永涛，姜弘佳，胡方正，等. 蜂蜜接合酵母及后发酵对黑糯米酒风味的影响[J]. 农业工程学报，2020，36(24)：301-309.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.035 http://www.tcsae.org

Fei Yongtao, Jiang Hongjia, Hu Fangzheng, et al. Effects ofand post-fermentation on the flavor of black glutinous rice wine[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(24): 301-309. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.035 http://www.tcsae.org

2020-07-23

2020-10-20

广东省重点领域研发计划项目（2018B020206001）；2019年广东省省级农业科技创新及推广项目（2019KJ01）；乡村振兴服务团队项目（KA200194310）

费永涛，副教授，研究方向为食品微生物学。Email：chsyt@126.com

刘功良，教授，博士生导师，研究方向为食品生物技术。Email：gongliangliu@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.035

Q93

A

1002-6819(2020)-24-0301-09