肝纤维化动物模型造模方法的研究进展▲

吕艳杭 吴姗姗 王振常 叶学劲

(1 广西中医药大学研究生学院，南宁市 530222，电子邮箱：2917138211@qq.com；2 广西国际壮医医院脾胃肝病科，南宁市 530201)

【提要】 肝纤维化是由各种损肝因素作用于肝脏，导致肝内结缔组织异常增生的病理过程，其主要病理特征是细胞外基质弥漫性沉积过多所致细胞外基质降解减少及肝窦毛细血管化，是各种慢性肝病向肝硬化甚至肝癌转化的必经阶段。成功制造出与各种致病因素相似的肝纤维化动物模型，可以为临床深入研究肝纤维化发病机制及治疗方法奠定基础。本文将从肝纤维化动物模型造模的方法、效果、用途及优缺点等方面进行阐述。

肝纤维化是一种慢性肝病在修复过程中的病理状态，其中慢性肝病包括慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、胆汁淤积性肝炎以及某些代谢性疾病等，其主要病理改变为肝内弥漫性细胞外基质的过度沉积。研究表明，肝纤维化作为所有慢性肝病的共同病理阶段，是肝硬化甚至肝癌发展的必经阶段[1-3]。大量研究证明，适当的治疗措施可逆转肝纤维化和早期肝硬化病理状态，控制肝纤维化的发展对于肝硬化甚至肝癌的防治具有至关重要的作用[4-9]。因此，逆转肝纤维化的治疗成为众多慢性肝脏疾病治疗的汇聚点。而制造各致病因素动物模型是深入研究肝纤维化发病机制及治疗药物的前提基础。本文将从肝纤维化动物模型造模的方法、效果、用途及优缺点等方面进行阐述，为今后研发治疗肝纤维化的药物提供临床基础研究。

1 化学药物诱导的肝纤维化模型

1.1 四氯化碳诱导肝纤维化模型 四氯化碳法诱导肝纤维化模型是一种经典的造模方法，因其具有造模成功率高、方法简便、费用低、时间短等优势，成为临床基础研究中肝纤维化造模的首选方法。皮下注射浓度为40%～60%的四氯化碳联合橄榄油是最常用的造模方法，每周注射2～3次，第8周时可成功制造肝纤维化模型[10]。四氯化碳法诱导肝纤维化模型的原理属于氧化应激反应，机制是四氯化碳在肝脏内代谢生成三氯甲基自由基，产生的自由基诱发脂质过氧化反应，生成的过氧化物包括丙二醛和4-羟基壬烯酸，它们以线粒体为靶点，破坏线粒体膜结构，从而损伤肝细胞膜，激活肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)释放Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶，促进HSC增生，导致肝纤维化。但四氯化碳毒性较大，大剂量使用可能导致实验动物的大量死亡，而小剂量使用又容易导致造模失败，为了提高造模的成功率，学者们对传统的四氯化碳造模法不断进行改良。目前常用的四氯化碳造模法主要包括腹腔注射、皮下注射及灌胃法。孙鹏等[9]通过改良四氯化碳注射浓度(40%)和注射时间(每3日1次，共14次)，采用四氯化碳大豆油溶液腹部皮下注射联合高脂蛋白饲料喂养、60%食用酒灌胃，大大降低了实验动物的死亡率，提高造模成功率。王永刚等[11]采用四氯化碳-橄榄油(含40%四氯化碳)3 mL/kg皮下注射(2次/周，共6周)，并以20%乙醇作为唯一饮用水灌胃造模，大大地提高了造模成功率，减少实验动物的死亡率。杨凤蕊等[12]采用3 mL/kg四氯化碳花生油溶液(含40%四氯化碳)联合苯巴比妥经腹注射也提高了造模成功率。

1.2 二甲基亚硝胺诱导肝纤维化模型 二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)也叫亚硝基二甲胺，其分子式为C2H6N2O或(CH3)2NNO，具有巨大的肝毒性，对基因结构及免疫功能也具有一定的损伤作用，其主要作用机制是使核酸、蛋白质发生甲基化，大剂量使用易导致动物死亡，多次小剂量腹腔注射、灌胃及吸入可以导致肝细胞坏死，细胞外基质增多致使HSC被激活，细胞表型由上皮型转化成间质型，促使HSC转化成纤维细胞，导致肝脏退行性坏死，形成肝纤维化。DMN诱导肝纤维化模型的成模率高、周期短、死亡率低及可控性高。高雅等[13]给予大鼠1.6 mL/kg DMN溶液腹腔注射，3次/周，42 d时大鼠出现明显的肝纤维化，即肝小叶消失、假小叶形成，与四氯化碳法相比大大缩短了建模的时间。王晶晶等[14]给予大鼠腹腔注射0.5% DMN生理盐水稀释液，剂量为2 mL/kg，1～3次/周，共注射28 d，停止使用DMN后肝纤维化不易自行吸收，提示病变稳定性强，DMN诱导的肝纤维化模型是研究抗纤维化药物的理想模型。李伟伟等[15]也通过腹腔注射质量分数0.5% DMN溶液2 mL/kg，每2 d注射1次，连续4周，得到稳定的肝纤维化模型。

综上所述，与四氯化碳法相比，DMN法具有周期短、方法简单的优点，停止给药后肝纤维化不易自行吸收恢复，但是DMN为致癌物质，其除了腹腔注射外，还可通过吸入(呼吸道、皮肤)等途径产生毒性作用，因此实验操作者在实验时应格外小心谨慎。

1.3 硫代乙酰胺诱导肝纤维化模型 硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)分子式为CH3CSNH2，其诱导的急性肝损伤机制是TAA进入细胞内，被细胞色素氧化酶P450氧化后生成自由基，自由基与肝细胞膜脂质结合，诱发脂质过氧化破坏肝细胞膜，造成肝细胞的变性坏死。主要的造模方法有灌胃、腹腔注射、皮下注射等，最常用的是皮下注射。秦冬梅等[16]使用灭菌注射用水将TAA配制成质量浓度为40 mg/mL的溶液，对大鼠进行腹腔注射，3次/周，第8周时肝纤维化模型造模成功。薛改等[17]按160 mg/kg，对大鼠隔天灌胃浓度为3%的TAA，每周称量体质量1次，严格按照体质量变化调整TAA的灌胃量，1周内体质量下降5%以内者维持原用量，1周内体质量下降5%～10%者用量减少为原用量的1/2，1周内体质量下降10%以上停止使用以避免死亡，结果显示该方法可以降低大鼠的死亡率。张帅等[18]对大鼠皮下注射0.03%的TAA，剂量为200 mg/kg，2次/周，8周时肝纤维化模型造模成功。综上所述，TAA造模时间较短，肝纤维化模型成功率高且相对稳定，死亡率低，可广泛应用于临床基础研究。但其易挥发、毒性大、需要加强个人防护。

2 酒精诱导的肝纤维化模型

酒精分子式为C2H6O，进入人体内的酒精有90%在肝脏中代谢，其肝损伤机制是酒精进入肝脏细胞，在脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系的作用下转化为乙醛，进而转变为乙酸，促使还原性辅酶Ⅰ与反应性辅酶Ⅰ比值升高，抑制线粒体三羧酸循环，使肝内脂肪酸代谢发生障碍，氧化减弱，使中性脂肪堆积于肝细胞中，从而引起肝细胞的炎症、变性、坏死，诱发胶原纤维堆积导致肝纤维化。目前主要通过31.5%酒精溶液(95%酒精与水混合制成)灌胃的方法制备酒精性肝纤维化模型[19]。有学者采用体积分数为50%的酒精诱导肝纤维化模型，16周时成功复制酒精性肝纤维化模型，证明此法操作简单、经济低廉[20]。李丰衣等[21]采用“白酒-吡唑-植物油”混合液灌胃法制备乙醇肝纤维化动物模型，即每天给予每只大鼠以4.8 g/kg白酒、24 mg/kg吡唑、2 mL/kg玉米油的混合液灌胃，灌胃量随体重的变化进行调整，同时喂养高脂饲料(基础饲料∶胆固醇∶猪油=79 ∶1 ∶20)，于16周时发现大鼠轻度酒精性肝纤维化形成，表明酒精复合因素灌胃可以成功制备肝纤维化模型，且成功率高、价格低廉、模型相对稳定。

3 非酒精性肝纤维化模型

非酒精性肝纤维化主要是指高脂肪、高蛋白及高胆固醇诱发的慢性非酒精性脂肪肝。随着人们生活水平的不断提高，慢性脂肪肝的患者不断增加，所以高脂高胆固醇诱导的肝纤维化也是当前研究热点。高脂高胆固醇所致肝纤维化的主要机制是：肝脏是脂肪代谢的重要场所，它可把血液中的脂肪酸合成为三酰甘油，三酰甘油与载脂蛋白结合为脂蛋白，并释放入血液；长期摄入过多的动物脂肪、植物油和糖类等高热量食物，过剩的营养物质在体内不能被充分利用，从而转化为脂肪储存起来，导致脂肪肝，肝脏的细胞“堆”满了多余的脂肪，从而形成肝纤维化。杨银花等[22]的研究表明，高脂饲料喂养Wistar大鼠能成功复制非酒精性脂肪肝，且价格低廉、成模率高、操作简便，于喂养第8周时多数大鼠肝脏肝纤维化形成。综上所述，高脂因素诱导的肝纤维化，造模周期短，操作方便，能复制出与人类相似的肝纤维化模型，可以很好地运用于人类非酒精性肝纤维化的研究。但喂养量尚未标准化，肝纤维化易自行吸收，模型相对不稳定。

4 胆管结扎性肝纤维化模型

胆管结扎性肝纤维化模型是通过人为结扎肝外胆管使其阻塞，形成肝纤维化。其结扎方法包括肝外胆管结扎法、胆管结扎后切断法和逆行性注入 N-丁基-2-氰基丙烯酸盐法三种方式。其主要机制是由胆管渐进性破坏、胆汁淤积及肝内炎症持续存在，导致肝细胞及胆管细胞进一步损伤，发展为肝纤维化。慕永平等[23]采用胆总管结扎法制备胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型，发现该模型可复制人类胆管梗阻造成肝纤维化的形态，且方法简便，造模周期短，肝纤维化稳定可靠，无须与毒性物质接触。

5 自身免疫性肝纤维化模型

自身免疫性肝纤维化的发病机制主要以遗传因素为主，其他因素是在遗传易感性基础上，导致机体免疫耐受机制破坏，从而产生针对肝脏自身抗原的免疫反应，诱发肝脏炎症坏死并进展为肝纤维化。实验研究中主要以动物血清或者人血清蛋白作为抗原，将其注射入动物体内，复制肝纤维化动物模型。

5.1 动物血清诱发的肝纤维化模型 实验室一般常选用猪血清、牛血清、马血清或血吸虫血清等给予实验动物注射，引起胶原纤维堆积，导致肝小叶消失，形成假小叶，诱发肝纤维化。由于猪血清较牛血清价格便宜，而血吸虫血清不易提取、价格昂贵，因此猪血清是实验室肝纤维化造模的首选试剂。有学者采用猪血清(0.5 mL/次，2次/周，共12周)对大鼠进行腹部注射，在造模期间每周处死1只大鼠，观察胶原纤维、肝纤维化指标及转化生长因子β1，用来判断大鼠成模情况，结果显示，猪血清可成功诱导肝纤维化模型[24-27]。赵宏伟等[28]在传统猪血清诱导肝纤维化(腹腔注射，0.5 mL/次，共12周)的基础上进行改良，加用高脂高胆固醇饲料(80%玉米粉+20%猪大油+0.5%的胆固醇)饲养大鼠，结果发现实验第4周时大鼠出现肝纤维化的现象，提示此法大大缩短了造模时间，方法简便，价格低廉，模型相对稳定。

5.2 人血白蛋白诱发的肝纤维化模型 人血白蛋白所致的肝纤维化分为致敏和攻击两个阶段。谢玉梅等[29]对人血白蛋白免疫攻击法制备大鼠肝纤维化模型进行改良，使用生理盐水稀释人血白蛋白，与等量的不完全福氏佐乳剂乳化，予尾静脉注射0.5 mL/次(含人血白蛋白4 mg)，共注射4次，前2次间隔14 d，后2次间隔10 d，并以30%乙醇为唯一饮用水，结果显示苏木精-伊红染色、V-G胶原染色向肝小叶延伸，交织成网状；进一步研究发现，在攻击阶段由尾静脉注射改为腹腔注射，或者在注射人血白蛋白的基础上加用四氯化碳，可增加造模成功率。

5.3 刀豆素蛋白诱发的肝纤维化模型 刀豆素蛋白诱导肝纤维化的机制是刺激T细胞有丝分裂，促进细胞因子(转化生长因子β、肿瘤坏死因子α等)的释放，引起炎症反应，进一步使肝炎发展成肝纤维化。有学者将1 g/L刀豆素蛋白溶于灭菌的磷酸盐缓冲溶液，按12.5 mg/kg给予每只大鼠进行尾静脉注射，1次/周，第6次注射1周后处死大鼠，取肝组织分析，发现刀豆素蛋白诱导的大鼠肝纤维化与人类肝炎病毒肝纤维化接近，随着刀豆素蛋白剂量的增加，肝损伤加重，此法操作简单快捷[30-31]。

综上所述，猪血清诱导肝纤维化模型是免疫性肝纤维化模型中最为经典的模型，其操作简单、价格便宜、造模周期短，与化学药物诱导的肝纤维化模型相比，稳定性更高，与临床肝纤维化最为贴近，可以更好地服务于临床基础研究。

6 其他因素诱导的肝纤维化模型

除了上述的造模方法，还有血吸虫感染实验动物诱导肝纤维化、营养缺乏性大鼠肝纤维化模型、基因缺陷性大鼠肝纤维化模型及病毒诱导的肝纤维化模型[32-34]。

7 小 结

到目前为止，肝纤维化动物模型的造模方法越来越多，也越来越完善，这为研究肝纤维化提供了坚实的基础。由于肝纤维化致病因素具有多样性，而目前肝纤维化动物模型大多是单一因素造模(化学药物、免疫肝损、酒精性肝损、高脂高胆固醇等)，无法用人类常见的肝炎病毒复制肝纤维化模型，仍然没有找到与人类肝纤维化完全相似的模型，今后应从多方面寻找肝纤维化诱导方法，进一步探讨肝纤维化的机制及治疗方法。