提高免疫组化染色质量的经验总结

2020-03-03秦永亭

临床医药文献杂志(电子版) 2020年1期

秦永亭

（江苏护理职业学院，江苏淮安 223300）

免疫组化染色技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用化学反应将显色剂标记于特异抗体上，借助于显微镜，通过观察抗原抗体结合部位从而确定组织细胞结构的一门新技术[1]。免疫组化染色技术周期长、程序复杂，任何一个环节失误都可能会导致实验的失败。我们在多年实践过程中，对其方法和步骤进行了一定的改进和优化，明显提高了免疫组化染色的效果，现将经验总结如下。

1 免疫组化染色不理想的原因

抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答并产生抗体的物质。抗体是由浆细胞合成和分泌的一种特殊性蛋白质，它能够与抗原发生特异性结合。人体组织中不同的蛋白质可能会存在相同的抗原，在应用克隆抗体时可能会存在交叉反应。因此，我们在免疫组化染色过程中应注意此问题，应将交叉反应的不利影响降到最低。

组织在制作过程中，化学试剂可能会封闭抗原，加热也可能会使抗原的肽链发生扭曲，导致抗原在染色过程中不易显示出来。因此，在免疫组化染色过程中需要选取合适的方式对抗原进行修复，常用的修复方式有酶修复法、高温高压热修复法、微波加热修复法等。

在染色过程中，组织固定位置的好坏也影响着实验结果。如果组织固定不及时，可能会导致组织溶解、干硬甚至变形。一旦出现组织自溶，则可能会引起抗原的丢失。组织干硬会导致蛋白质变性，引起抗原功能的改变，导致染色失败。

2 实验过程及注意事项

2.1 试剂准备

所有试剂在未使用时应置于冰箱4℃储存，而且应定期监控冰箱的恒定制冷功能。对于使用频率较低的试剂，应标明过期时间。批量配置的修复液，应逐次使用，并用标签做好标记，并做好防霉措施。蒸馏水不宜过早准备，且在制备过程中应避免污染，并且要预防盛蒸馏水的水桶内壁长菌和发霉。

2.2 组织的处理

组织的处理包括固定、脱水、透明、浸蜡等多个环节。组织的固定是获取最佳组织的前提，而且会直接影响免疫组化染色的结果。选择合适的固定液，能最大限度地保存好组织细胞的形态和抗原性，并防止抗原弥散，增强抗原的定位。组织的固定可根据不同组织选取合适的固定液，淋巴组织可选取B-5固定液，脑组织选用4%的甲醛溶液效果最好。固定时间小标本为4～6小时，大标本为18～24小时。组织固定时间不宜超过24小时，否则由于甲醛和组织蛋白间的交联等作用会导致抗原决定簇被覆盖甚至丢失，从而影响抗原表达活性[2]。此外，为了保证组织固定的效果，固定液的使用量应为组织块体积的4～10倍。组织脱水也是保证免疫组化染色质量的重要环节。如果组织脱水不彻底，容易导致组织脱片的现象。为了保证组织脱水的效果，实验室应定期更换试剂，并做好相应的记录。

2.3 制片

在制片过程中，皱褶、气泡、厚薄不一等问题都可导致切片在后期修复、浸洗过程中发生脱片现象。因此，我们在切片过程中要根据组织的特点选用最合适的处理方法。例如，对于甲状腺组织，可采用细削慢切、浸化蜡面、增加展片时间的方法。切片的厚度2～3 um最佳，且应无刀痕、气泡、皱褶等。烤片的温度和时间关系着切片贴附的牢固程度，建议温度为65℃～68℃，时间为60～90分钟。对于容易发生脱片的组织，烤片时间可适当延长，但应避免烤片时间过长。烤片温度不能过高，否则会对组织造成损伤。同时，烤片温度也不能过低，如果低于60℃，切片在后面修复和浸洗过程中容易出现脱片现象。

2.4 抗原修复

抗原修复是免疫组化染色的关键步骤。抗原修复可以使组织中抗原决定簇充分暴露，从而增强抗原与抗体的免疫反应。针对不同抗体，应选择不同的抗原修复方法。目前常用的抗原修复法有高温高压热修复法、酶修复法、微波加热修复法等。高温高压热修复法因为受热均匀，易掌握等优点，已成为目前使用最广泛的一种修复方法[3]。当高压锅内水沸腾后，在高压阀的作用下，锅内温度可达130℃。该法通过高压和高热使组织在甲醛固定过程中形成的醛键发生断裂，从而充分暴露抗原的决定簇。一些较难修复的组织完全可以通过此法进行修复，近几年关于抗原修复的研究表明此法效果较好。但由于高温高压会导致溶液的分子处于高速运动状态，因此容易出现组织与玻片分离现象。因此，在暴露抗原决定簇的前提下，可针对不同的抗原选择不同的修复方法。对于胞质或胞膜阳性的抗原，可选择微波加热修复法；而对于胞核阳性的抗原，可采用高温高压热修复法[4]。采用高温高压对抗原修复时，为了更好地控制时间和锅内温度，可采用电磁炉进行加热。锅内温度控制在130℃左右即可，温度过低会导致抗原修复效果不佳，温度过高则容易出现脱片现象。

2.5 染色过程

免疫组化染色是一种酶促反应，标有显色剂（酶、荧光素等）的抗体与抗原结合后，通过化学反应使显色剂显色，从而确定组织细胞中的抗原部位。在染色过程中，如果组织块固定脱水不充分或切片过厚时，剧烈的洗涤可能会导致组织出现脱片现象[5]。对于此类切片，洗涤要注意轻柔，可将缓冲液顺着被抬高的玻片一侧进行冲洗，也可选用浸泡法洗涤，但不能直接冲洗组织。孵育盒内应加入少量的蒸馏水，保证切片在整个染色过程中保持湿润，不会出现干片现象。但加入的蒸馏水不宜过多，否则水蒸气在盒盖上会聚成水滴，可能会滴落到切片上。因此，最后加入抗体时，应注意切片上是否有水滴。如果有，应将切片上的水弄干，避免抗体被稀释影响实验结果。