动物血清的成分及在细胞培养中的作用

石嘉琛，王家敏，乔自林 *

（1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学工程学院，甘肃 兰州 730030）

20世纪50年代，研究人员开始将血清作为一种细胞培养基添加物使用，获得了良好的培养效果。添加血清的培养基的效果与未添加血清的培养基相比，细胞活率更高，生长密度更大，持续培养时间更长。一些要求较高的细胞需要在培养体系加入自体血清，如大鼠关节软骨细胞[1]、猪耳缘成纤维细胞[2]等。新生牛血清或胎牛血清是细胞培养中常用的生长补充剂，主要是因为它具有高水平的生长刺激因子和低水平的生长因子。使用牛血清作为培养基添加剂在建立原代细胞培养、维持器官/组织外植体和干细胞繁殖的情况下仍然是必要的，因为血清具有促进分化的功能，还具有运输携带激素（如转运蛋白）、矿物质和微量元素（如转铁蛋白）和脂质的蛋白质的功能，且含有贴附和扩散因子，在维持pH值或直接抑制蛋白酶作用方面也有一定效果，使用血清就不需要为每个细胞系和菌种优化培养基，这可节省大量人力物力，加快研究进程[3]。

1 血清所含成分对细胞培养的影响

血清组成成分十分复杂，包含蛋白质，多肽，激素等一些细胞生长的有益因子，如白蛋白可作为载体蛋白携带小分子物质，维持细胞生长，还具有缓冲pH的作用。可能污染病毒、支原体等外源微生物的新生牛血清可通过灭能处理进行灭活，但同时可能使血清内有利于细胞培养的生物活性物质变性降解，从而影响细胞的培养[4]。一项关于胎牛血清组成的研究表明，随着时间的增加，几种细胞外基质和结构蛋白的数量以及营养相关蛋白、细胞扩散蛋白的数量都会发生变化，这种差异性不仅迫使大多数实验室进行他们自己的胎牛血清和新生牛血清筛选，并且在此之后使用“预先选择”的批次，它也常常使不同研究者的数据处理变得困难[5]。

2 血清浓度对细胞培养的影响

在一定范围内，提高细胞培养基含有的血清含量，可促进细胞分化速度,但血清浓度过高会导致细胞生长状态异常[6]。一般来讲，在培养基中添加5%～20%的血清可满足绝大多数细胞生长所需的营养物质。采用T75方瓶和转瓶培养PK15细胞时只需要在培养基中添加5%的血清即可生长状态良好，经过72 h的培养后，细胞增长倍数均为10倍以上[7]。

细胞在含有一定培养基血清浓度的细胞培养基中生长时，血清所含的生长因子可维持细胞的快速生长，有助于阻止细胞的机械损伤[8]。一项培养基中血清添加量对于成纤维细胞的影响表明，10%血清浓度条件下成纤维细胞形态稳定，增殖速率较高，但40%血清浓度对成纤维细胞有损害作用，出现了细胞数量下降的现象[9]，肝细胞原代培养中血清浓度为20%时会对肝细胞造成一定伤害[10]。血清是细胞生物制品生产中的主要成本，幼小仓鼠肾细胞（BHK21细胞）经过一段时间的驯化可以逐步适应低血清培养条件，但其营养物质代谢速率、乳酸和氨的积累速度降低[11]。添加15%FBS的培养基可取得较好的牛原代肌卫星细胞和前体脂肪细胞共培养效果[12]。转瓶培养是疫苗生产中常用的贴壁细胞培养方式，猪乙型脑炎病毒可在Vero细胞中增殖，维持液的血清浓度不仅影响细胞生长，对病毒效价也有一定影响，血清浓度在1%～4%范围内时，病毒毒价随浓度升高而升高，维持液血清浓度超过 4%后，毒液的效价下降[13]。

3 血清种类对培养效果的影响

血清根据来源动物品种不同可分为人血清、马血清和牛血清等。牛血清来源较丰富，目前广泛应用于细胞培养。牛血清制品可分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清，在这三种血清制品中，胎牛血清品质最高，胎牛因未接触到外界，血清中的细胞毒害成分最少，但其价格在牛血清中是最为昂贵的[15]。

胎牛血清（Fetal Bovine Serum，简称FBS）是经心脏采集230～240日龄的胎牛全血，分离血清，经滤过除菌制成，是疫苗生产的重要原辅料之一[18]。胎牛血清是细胞培养中效果最好的天然培养基，可提供细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子，还能发挥酸碱缓冲液作用[17]。新生牛血清指采集出生时间小于24 h的健康牛犊的血清，它是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有血小板促生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等，在可获得较好的细胞生长增殖效果[19]。

目前市场上血清种类繁多，李自良等[15]对国产胎牛血清、进口胎牛血清、国产新生牛血清对MDCK细胞促生长效果做了相关研究，结果表明，国产新生牛血清可连续传代MDCK细胞，细胞生长良好，排列紧密，不同代次MDCK细胞长成致密单层时细胞形态基本一致，但新生牛血清的有效集落数低于胎牛血清，这可能与二者所含的激素和其他活性物质等组分与比例不同有关。王梅珂等对于国产血清和进口血清对于Vero细胞形态、细胞汇合度的影响进行了研究，发现国产的一批血清细胞收获量值大于3.00×108个/ml，且细胞相对增长率大于90%，与进口血清促细胞生长效果相近，可替代进口血清[16]。

4 细胞培养使用血清存在的不足

牛血清来源广，即便是同一来源，同一批次的血清质量也存在很大差异，具有因化学、蛋白质方面差异和内分泌参数的血清变异性，这提示我们在解释使用血清补充剂可能具体定量的实验结果产生干扰或调节，血清作为细胞生长和维持的重要物质，在细胞培养中发挥重要作用的同时，也带有许多至今无法解决的问题和弊端[20]，如血清中成分复杂，不能准确加以区分血清批次间差异很大，且血清的保存期短，给批次生产的标准化和连续化带来限制。牛血清在使用时需要低温储存，然后解冻使用，血清中的脂蛋白产生沉淀，营养价值流失，从而影响细胞的营养物质供应，造成细胞生长缓慢。

生物技术的发展、生物医学的进步都离不开细胞培养，很多牛血清供应商为小型企业，质检存在很多局限性，且生产环境是否合格无菌，设备的科技程度也因成本的限制而存在问题。2000年10月1日，《中国生物制品主要原辅材料质控标准》开始实施，牛血清质量虽有提升，但影响牛血清质量的主要因素是大肠杆菌或噬菌体的污染，其次是细胞增殖检查及细菌内毒素[21]。此外，血清在培养基中的存在使产品的分离纯化变得更加复杂，牛血清作为细胞培养常用的天然培养基，其成本较高，且易被外界的杂菌污染[22]。牛血清蛋白可能内化在干细胞上，刺激产生免疫原性，因此，可能会产生许多潜在的问题，如病毒和朊病毒的传播，或由于牛蛋白附着在细胞上而引起的免疫反应，这些细胞在移植后充当抗原基质。

5 结语

血清作为细胞培养中大量使用的培养基添加物，具有其他物质无法比拟的优势，使用血清最大的缺点是其未经测试的生物安全性和补充基本培养基的额外成本，针对这些问题，需要制定一个全面，科学的血清生产行业规范，加速产业升级，使用血清替代品，主要是使用化学确定的培养基，可减轻风险，但目前血清仍然是建立和维持原代细胞系和连续细胞系的过程中使用最广泛的添加物，对其化学组分的不明确也制约着血清的生产和质量把控，一旦成分明确，相信血清将会成为生命科学研究中的一把利器。