垂盆草配方颗粒的HPLC 指纹图谱研究

★ 董玉娟 周敏 胥爱丽 李素梅

（1.广东省第二中医院 广州 510095；2.广东省中医药工程技术研究院 广州 510095）

垂盆草配方颗粒是采用符合质量标准的垂盆草饮片经一系列的提取、浓缩、干燥、制粒等制备方法制粒而成，具有清热解毒、利湿退黄功效。目前对垂盆草药材、配方颗粒及含垂盆草药材复方制剂的质量控制研究大多采用薄层色谱法鉴别，高效液相色谱法或紫外吸收法测定含量［1-10］等，尚未见垂盆草配方颗粒指纹图谱相关研究，且未见垂盆草配方颗粒与其饮片之间的关联性研究。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）建立了垂盆草配方颗粒HPLC 指纹图谱的分析方法，研究不同批次的样品，并比较了配方颗粒与饮片之间的差异。本研究为垂盆草配方颗粒质量的整体有效控制提供了科学方法与实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters e2695-2998型高效液相色谱仪，Empower 2 数据处理软件系统；SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm，5μm） 色 谱 柱；KQ5200DE 型数控超声波清洗器；Mettler XS205DU电子天平；MilliPore Advantage A10 自动纯水机。

1.2 试药垂盆草药材由广东一方制药有限公司提供，刘法锦研究员鉴定为景天科植物垂盆草Sedum sarmentosumBunge 的干燥全草；芦丁对照品（批号：100080-200707）购于中国食品药品检定研究院；垂盆草配方颗粒（1.2g 相当于15g 饮片）样品购于广东一方制药有限公司，批号见表1。

甲醇、乙腈为色谱纯；液相用水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

表1 垂盆草配方颗粒批号

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备精密称取4.46mg 芦丁对照品，置于容量瓶中，加入甲醇制成每1mL 含44.6μg 芦丁的对照品溶液，置冰箱内保存，备用。

2.2 垂盆草配方颗粒供试品溶液的制备精密称取样品S1～S10 各约1.0g，置于锥形瓶中，加入25mL 50%甲醇，称重，超声处理30min，取出，放冷，补重，摇匀，取0.45μm 微孔滤膜续滤液。

2.3 垂盆草药材供试品溶液的制备取10g 药材，加入200mL 水，煮沸30min，蒸发至干，加1.0g 硅藻土搅拌均匀，置于锥形瓶中，同“2.2”项的方法制备垂盆草药材供试品溶液。

2.4 色谱条件的建立采用Waters XbridgeTMC18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以甲醇（A）- 0.4%磷酸（B）为基础流动相，研究了样品提取方法、检测波长、色谱柱、流动相体系、柱温及流速，以确立最佳色谱条件。

经试验，建立本实验的最佳色谱条件为：SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇（A）- 0.1%磷酸（B），按表2 进行梯度洗脱；检测波长：265nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL。

表2 流动相梯度

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验制备垂盆草配方颗粒供试品溶液（S7）并连续进样6 次。中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算6 次所得指纹图谱与共有模式图谱的相似度均＞0.99；参照峰为指纹图谱中的10 号峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 值均＜2%，表明测试仪器稳定，精密度高。

2.5.2 重复性试验取同一批号样品（S7）6 份，制备供试品溶液，并进行检测。计算6 次所得指纹图谱与共有模式图谱的相似度均＞0.99；共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 值＜2%，表明该实验中建立的方法具有良好的重复性。

2.5.3 稳定性试验取供试品溶液（S7），分别于0、4、8、12、16、24h 进样。计算6 次所得指纹图谱与共有模式图谱的相似度均＞0.99；共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 值＜2%，说明供试品溶液在24h 内具有良好的稳定性。

2.5.4 空白试验及对照试验将芦丁对照品、垂盆草药材以及垂盆草配方颗粒测得的HPLC 色谱图进行比较。结果见图1-3，并且第22 号峰确定为芦丁，配方颗粒与药材的相关性较好。

图1 芦丁对照品溶液HPLC色谱图

图2 垂盆草药材HPLC色谱图

图3 垂盆草配方颗粒HPLC色谱图

3 垂盆草配方颗粒指纹图谱模型的建立

对10 批垂盆草配方颗粒指纹图谱的色谱峰进行匹配，匹配结果见图4，得出共有模式色谱图见图5。共确定了25 个共有峰，其中10 号峰为参照峰。10 批样品共有峰的相对保留时间及相对峰面积数据见表3-4。与共有模式相比，不同批号垂盆草配方颗粒样品的相似度数据，见表5。

表3 10批垂盆草配方颗粒共有峰相对保留时间

表4 10批垂盆草配方颗粒共有峰相对峰面积

图4 10批垂盆草配方颗粒样品指纹图谱匹配色谱图

图5 不同批号垂盆草配方颗粒HPLC共有模式图

表5 不同批号垂盆草配方颗粒样品与共有模式比较的相似度

利用相似度评价软件分析，得出垂盆草配方颗粒的HPLC 共有模式图上有25 个共有峰。通过表观分析，不同批号垂盆草配方颗粒都在6.8、7.4、8.8、9.4、13.0、15.3、21.6、23.7、24.2、26.9、28.1、34.2、38.5、40.2、41.3、49.3、57.1、65.9、70.2、83.3、88.0、90.4、91.0、93.3、94.9min 左右出峰，可以初步认为这是不同批次垂盆草配方颗粒指纹图谱共有峰的保留时间。

4 讨论

（1）本实验考察了不同厂家的色谱柱，结合色谱图的峰数、分离度、峰形、基线以及柱压，最后选用SHISEIDO Capcell park MC C18（4.6mm×250mm， 5μm）色谱柱为本实验用色谱柱。

研究流动相体系时，甲醇-水流动相获得色谱峰的峰形与分离度较差，但在流动相体系中加酸后的甲醇-0.4%磷酸流动相，色谱峰的峰形得到改善，分离度良好；将甲醇换为乙腈按上述梯度进行洗脱，色谱峰分离差。最后，研究了不同浓度的酸在流动相中的作用，甲醇-0.4%磷酸与甲醇-0.1%磷酸的色谱图基本一致，虽然两种流动相体系的pH 值均在色谱柱的适用范围内，但考虑到酸的量较大会对色谱柱有一定的损害，因此，最终采用甲醇-0.1%磷酸作为实验的流动相体系。

（2）比较垂盆草配方颗粒与药材的指纹图谱，结果基本一致，表明配方颗粒与药材有很好的相关性，临床上可以代替药材使用。另外，从每个批号的垂盆草配方颗粒的HPLC 色谱图上看出，每个批号的垂盆草配方颗粒中成分大致一样，但含量有所不同，这可认为是与原料的生长环境、采收时间或制备工艺过程等因素影响有关。从表5 的相似度数据中，9 批样品的相似度高于0.9，只有1 个批号样品的相似度稍低于0.9，可能是由于投料所用垂盆草药材与其余批号投料所用的垂盆草药材产地及质量不一样所致，因此，原料药材的来源应在生产过程中固定，以保证垂盆草配方颗粒原料药材质量的稳定性和一致性，才能保证其配方颗粒的质量稳定。