牙鲆耐低氧性状相关的QTL 定位研究

2020-03-03翁歆之

科学养鱼 2020年1期

翁歆之

(台州市水产技术推广总站，浙江台州 318000)

牙鲆(Paralichthys olivaceus)属鲽形目、鲽亚目、鲆科、牙鲆亚科、牙鲆属。分布于中国、日本和韩国等东北亚沿岸，是重要的经济鱼类，也是重要的海水养殖对象。其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，还具有一定的药用价值，深受人们的喜爱。近年来，牙鲆的自然资源衰退严重，进行大规模的人工养殖势在必行。耐低氧性状是高密度集约化养殖中最重要的经济性状之一，有研究表明，耐低氧能力与鱼类的生长发育、摄食繁殖、代谢行为、免疫能力等有着密切的联系。因此，筛选和培育出耐低氧的牙鲆优良品种是高密度、高效益养殖模式的迫切需要。

数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)的检测和定位是成功进行分子标记辅助选育(MAS)的重要前期工作。早期的QTL定位多见于植物、水稻、禽兽类等，水产经济动物的QTL研究相对滞后。而关于牙鲆的QTL定位，特别是抗病、耐高温等相关性状的研究更是少之又少。如Fuji等筛选到了牙鲆抗淋巴囊肿病的性状相关的主效位点，并培育出具有抗淋巴囊肿病的后代，成功应用到商业化生产；卢钟磊等利用微卫星标记确定了两个与牙鲆耐热相关的位点；Ozaki等得到了牙鲆与海豚链球菌(Streptococcus iniae)相关的QTLs；Wang等定位得到4个与牙鲆抗鳗弧菌病性状相关的QTL区间。但是，关于牙鲆耐低氧相关的QTL定位尚未见报道。

本研究以167尾牙鲆F2KP-CBB家系作为实验材料，采用140个微卫星分子标记，首次对牙鲆耐低氧性状作QTL定位，以期为牙鲆分子标记辅助选择育种提供基础和依据。

一、材料与方法

1.实验材料以神奈川水产技术中心培育的牙鲆(长谷川研究员提供)为实验材料。由亲本KPC家系(耐低氧)与亲本KP-B家系(不耐低氧)交配，获得F1KP-CB，再由F1KP-CB与亲本KP-B(不耐低氧)交配，获得F2KP-CBB。

2.耐低氧实验将F2KP-CBB 167尾牙鲆个体放入内有800升海水的1000升圆形缸里(保持水温25℃，溶氧11毫克/升)培育。实验前1天将167尾个体(平均体长16.8厘米，平均个体重51.9克)转移到1000升的圆形缸中，并放入亲本KP-C、亲本KPB、F1KP-CB各10尾作为对照样本，禁食24小时。开始实验时，整个实验水温保持25℃，止水，停止供给氧气。在F2KP-CBB大概死亡一半的时候停止实验(此时溶氧为0.9毫克/升)，按照死亡顺序编号，并立刻剪下死亡个体的尾鳍，保存在99%酒精中。存活的牙鲆抽取血液，打入体内标记后返回缸中。整个实验过程中对每个死亡个体都记录下死亡时间，氧气浓度每15分钟记录1次。

3.基因组DNA制备用酚-氯仿抽提法进行基因组DNA提取，并用紫外分光光度计测量DNA浓度，将浓度稀释至50纳克/微升。

4.PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳利用PCR扩增方法对本实验群体进行基因型检测。PCR反应体系包括0.055皮摩尔特异性荧光引物(5’标记FAM荧光)0.005微升，下游引物0.05微升，10×Buffer(Mg2＋)1.1微升、2.5毫摩尔dNTPs 0.88微升、1%BSA 0.11微升、ExTaq DNA聚合酶0.055微升以及50纳克的DNA模板1微升。PCR反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，62℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物中加入等体积的loading dye(95%formaide，10毫摩尔EDTA，pH 8.0)，95℃变性5分钟后迅速放到冰上。后经6%变性聚丙烯酰胺凝胶上点样5微升，电泳1.5～2小时；在扫描仪(FLA-9000，FUJIFILM)上，使用Bio-image Analyzer软件成像。

5.QTL定位及表型数据处理参考Castaño-Sánchez等构建的牙鲆高密度遗传连锁图谱，选择覆盖牙鲆所有连锁群的微卫星标记，共140个，平均间距10～15厘摩尔。

基因分型分两步开展：先从F2KP-CBB中取出88尾个体(44尾死亡个体、44尾存活个体)，死亡个体取最开始死亡的44尾，对筛选的微卫星标记进行第一次检测。然后，第一次检测中表现出差异性的微卫星标记并加上其附近的微卫星标记对167尾个体进行第二次扩大检测，统计基因分型。

采用应用软件Map Manager QTXb20进行QTL定位，设定LOD值为3。根据实验中牙鲆死亡时间，采用两种不同模式进行分析，在模式一中，将死亡的44尾牙鲆定义为“0”，存活下来的44尾定义为“1”；模式二中，实验所用167尾牙鲆按照死亡时间进行分析。

二、结果与分析

1.耐低氧实验耐低氧实验进行了约9个小时，实验结束时溶氧为0.9毫克/升。F2KP-CBB 167尾个体中75尾死亡(44.9%)、92尾存活(55.1%)，表明存活的个体比死亡的个体具有一定的耐低氧性。对照组中，KP-B全部死亡，KP-C的死亡率为30%，F1KP-CB死亡率为60%。

2.QTL定位利用140对微卫星标记对F2KPCBB 88尾个体进行解析，其中90个(64.4%)标记统计得到基因分型结果。结果显示(表1)，雌性遗传图谱上共检测到6个标记与耐低氧性状存在显著的相关性(P＜0.05)，分别分布于连锁群LG4、LG7、LG10和LG17上，4个标记与耐低氧性状存在极显著的相关性(P＜0.01)，都分布于连锁群LG24上。其中LG24上的Poli1482TUF的LOD值最大，为2.08，可解释的表型变异为10%。雄性遗传图谱上，共检测到4个与标记耐低氧性状存在显著的相关性(P＜0.05)，分布于LG10、LG24上。

表1 F2KP-CBB 88尾个体耐低氧性状相关QTL定位及其基因效应

利用上述有差异性表现的微卫星标记对于167尾个体进行扩大检测，结果显示(表2)，雌性遗传图谱上，共得到2个显著性相关标记(P＜0.05)和7个极显著性相关标记(P＜0.01)，分别分布于5个连锁群(LG4、LG7、LG10、LG17和LG24)上。同样LG24上Poli1482TUF的LOD值最大，为4.11，可解释的表型变异为11%。

表2 F2KP-CBB 167尾个体耐低氧性状相关QTL定位及其基因效应

三、讨论

1.耐低氧实验在进行耐低氧实验中，为了保证耐低氧实验的准确性，因此在大约死亡一半并且溶氧达到0.9毫克/升时停止了实验。

2.QTL 定位 Castaño-Sánchez 等使用了1268个SSR标记、105个SNP标记和2个基因，构建了牙鲆第二代高密度遗传连锁图谱，此图谱由24个连锁群组成，雄性和雌性图谱总长度分别为1147.7厘摩尔和833.8厘摩尔。本研究基于该图谱进行分析，可以较为准确地定位耐低氧相关性状QTL区域。

本研究中，第二次扩大检测得到的QTLs都定位于牙鲆的雌性遗传基因图谱上，这与Fuji等成功将褐牙鲆抗淋巴囊肿病的性状相关QTL定位在雌性遗传图谱上的结论相一致。由于牙鲆的雌性遗传图谱的重组率高于雄性遗传图谱，因此定位于雌性遗传图谱的QTLs更适用于今后的分子标记辅助选择育种。同时，本研究得到的极显著标记Poli1482TUF(LG24)的LOD值为4.11，可解释的表型变异为11%。有研究表明，可解释的表型变异超过10%，即可有效地进行分子标记辅助选择育种。

此外，本研究还尝试在Poli1482TUF和Poli1024TUF附近设立了5对引物，试图找到更大的LOD值，但尚未成功。今后将进一步对此区间进行分析，并将筛选到的Poli1482TUF放到更多的群体中进行进一步验证。