无创DNA阳性结果的验证分析及临床意义

黎洛冰 梁西岚 聂俊玮

[摘要]目的 对比分析无创DNA产前检测阳性结果与产前诊断结果，为无创DNA临床应用提供临床应用依据。方法 选取2016年1月～2018年3月在茂名市产前诊断中心因无创DNA产前检测结果阳性的孕妇86例给予羊水或脐静脉穿刺进行核型分析，并对参与无创DNA产前检测结果阴性的孕妇5008例进行随访。观察无创DNA检测结果准确率、不同危险分析度孕妇检测结果的准确性。结果 86无创DNA阳性结果，经染色体核型分析验证，无创DNA检测准确率为66.28%，其中18三体检测准确率为100.00%，21三体检测准确率为82.93%，13三体及性染色体异常的检测准确率分别为66.67%、60%。高龄组、唐氏高风险组、其它高危因素组孕妇无创DNA阳性准确率分别为62.86%、72.73%、65.52%，三组准确率比较，差异无统计学意义（P>0.05），其余5008例无创DNA结果阴性者截止2018年3月经随访未发现有唐氏综合征患儿出生，其他先天性畸形7例，其中先天性心脏病3例，多指/趾2例，唇腭裂2例。所有胎儿均正常出生。结论 无创DNA是产前筛查21、18、13三体综合征的有效方法，对于其它染色体异常也具有重要提示意义。但无创DNA存在假阳性，对于无创DNA检测结果阳性，建议进一步行介入性产前诊断确诊。

[关键词]无创DNA;产前诊断;出生缺陷;染色体

[中图分类号]R714.15

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2020）01-256-05

预防胎儿出生缺陷，对严重智力障碍及畸形的胎儿尽早检出并及早终止妊娠是提高出生人口质量的重要手段之一[1]。染色体非整倍体异常是导致胎儿出生缺陷的重要原因，有数据统计缺陷儿的出生率为活产儿的3%，全世界每年约有500万婴儿出生时伴有缺陷，平均5～6min即有一名出生，其中85%发生在发展中国家[2]。我国先天缺陷儿的总数为80～120万，占我国出生人口总数的4%。这部分新生儿既没有很好的生存质量，同时也为家庭和社会带来巨大的负担。胎儿染色体病的传统产前诊断方式是通过获取胎儿的绒毛、羊水、脐血等来进行诊断，但是这些侵入性操作对胎儿和孕妇均有一定风险，可能导致宫内感染的发生，甚至有可能导致流产等不良后果[3]。无创DNA产前检测技术，是一种利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段进行测序并将结果进行生物信息分析的技术，该技术不需要取得胎儿的组织，仅通过孕妇的静脉血即可进行检验[4]。为了验证无创DNA阳性结果的准确性，探讨其在临床应用价值，我院进行了本次研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2016年1月～2018年3月在茂名市产前诊断中心因无创产前基因检测结果阳性的孕妇86例和5008产前诊断中心因无创产前基因检测结果阴性的孕妇进行临床研究，年龄22～46岁，平均（32.1±5.8）岁，孕周12～24周，平均孕周（18.7±5.0）周，均为单胎妊娠。根据患者风险原因分为高龄组35例，唐氏高风险组22例，其他高危因素组29例，三组孕妇年龄、孕周比较，差异无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。纳入标准[5]：（1）自愿行羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺术的孕妇;（2）使用染色体核型分析对无创结果进行验证，染色体微缺失或微重复还建议进行Array-CGH项目检查;（3）孕妇病例资料完整，随访取得妊娠结局。排除标准[6]：不能按照要求完成介入性产前诊断的孕妇。

1.2方法

1.2.1羊水穿刺 穿刺前常规给予血常规、地贫电泳、凝血功能、乙肝、梅毒、艾滋病等检测，在超声下观察胎盘位置等情况，确定进针点，无菌条件下经腹抽取羊水30mL，羊水标本置入无菌离心管中1200r/min离心10min，后去上清，留取沉淀（羊水细胞），加入羊水培养液10mL浑匀接种于培养瓶中（每瓶5mL），培养7d见有细胞克隆形成，换液，继续培养，常规收获及G显带。制得的染色体标本在高倍镜下计数20个分裂相，分析3～5个核型，嵌合体计数100个。

1.2.2脐静脉穿刺 超声引导下选取脐带游离段抽取脐带血1.5mL，接种于外周血淋巴细胞培养液中，接种两瓶，每瓶0.3mL。37℃培养箱中培养72h后进行常规收获、制片、G显带、染色体核型分析。

1.3分析指标[7]

所有参与本次研究的孕妇均给予随访，观察所有无创DNA检测阳性孕妇的羊水或脐静脉穿刺染色体核型分析结果，并以此为最终结果，观察无创DNA检测结果的准确率。观察不同危险分析度孕妇的无创DNA检测结果的准确性。

危险度分级，高龄组：孕妇预产期年龄>35岁;唐氏高风险组：预产期年龄<35岁，唐氏综合征血清学筛查提示21三体综合征风险值≥1/270或18三体综合征风险值≥1/350;其他高危因素组：包括唐氏临界风险（预产期年龄<35岁，唐氏综合征血清学筛查提示21三体综合征风险值在1/500～1/270或18三体综合征风险值在1/500～1/350）、唐氏血清学筛查单项指标异常、超声软指标异常。

1.4统计学处理

用SPSS19.0统计学数据处理软件处理研究中所有相关数据，计量资料（x±s）表示，采用t检验，计数资料以百分数表示，采用X2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1羊水或脐靜脉穿刺诊断结果

无创DNA阳性结果的86例孕妇，均进行羊水或脐血染色体核型分析。在这86例细胞染色体核型中，57例见明显异常，28例未见明显异常，还有1例为Y染色体倒位。在57例异常核型中，21三体综合征所占比例最高，占异常核型的59.6%（34/57）。21三体、18三体、13三体共43例，占异常核型的75.4%（43/57）。无创DNA提示的21、18、13三体高风险、性染色体及其它染色体异常，通过核型分析验证，都有未见异常的情况，存在假阳性。见表1。

2.2无创DNA与产前诊断结果比较

以羊水或脐静脉穿刺结果作为最终诊断结果，经验证，无创DNA检测准确率为66.28%，其中18三体检测准确率最高，为100.00%，其次为21三体，检测准确率分别为82.93%，13三体的检测准确率为66.67%。无创DNA提示性染色体异常20例，经验证，12例为性染色体异常，检测准确率为60%。12例无创DNA结果示染色体微缺失及微重复的，均经核型分析验证，其中8例同时行Array-CGH，结果提示2例胎儿的染色体及Array-CGH结果异常，检测准确率为14.29%。见表2。

2.3不同危险度孕妇无创DNA阳性准确率比较

高龄组、唐氏高风险组、其它高危因素组孕妇无创DNA阳性准确率分别为62.86%、72.73%、65.52%，三组准确率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4无创阳性随访情况

本研究对86例无创DNA结果阳性的孕妇进行了随访，57例羊水染色体核型明显异常者，引产55例，其中2例胎儿性染色体异常，核型为47，XXY及Mos45X[4]/46，XX[32]，知情理解后，孕妇拒绝引产，选择继续妊娠。另外，29例无创DNA假阳性结果，经染色体核型和QF-PCR确认染色体核型正常，经电话随访，胎儿出生后健康，未发现异常。

3 讨论

无创DNA产前检测技术是一种新型的胎儿染色体非整倍体检测技术，仅需要采集孕妇的静脉血，利用新一代DNA测序技术，对母体外周血浆中游离的DNA片段进行测序，将结果进行生物信息分析，以获得胎儿的遗传信息，以此来检测胎儿是否患有21、18、13三体综合征[8]。Lo等在1997年首次发现母体外周血中胎儿游离DNA的存在。并且开发一套新技术，证明了胎儿游离DNA诊断遗传性疾病的可行性，开创了利用第二代基因测序检测基因异常的新途径[9-10]。

胎儿染色体非整倍体异常是临床最常见的导致胎儿发育异常的染色体疾病。是由于亲代之一的生殖细胞在发生减数分裂形成配子时，染色体未发生分离，导致了三体的发生[11]。其中以21三体综合征最为常见，60%患儿在妊娠早期即流产，存活的患儿会出现明显的智力落后、特殊面容以及生长发育障碍[12]。因此对于高危孕妇，进行产前筛查及诊断，可以有效避免缺陷儿的出生。但目前应用最为广泛的孕妇血清学筛查效率低，假阴性率及假阳性率均高，存在漏诊风险，而传统的介入性产前诊断方式，属于有创性操作，有出血、损伤胎儿的风险，甚至可能诱发流产的发生[13]。无创DNA则避免了上述风险事件的发生。无创DNA使用高度敏感的检测方法将DNA片段进行量化，从而能较为准确地检测出13三体综合征、18三体综合征、21三体综合征。目前国际上把它作为传统产前诊断技术的有效补充手段[14]。

从本次研究来看，以羊水或脐静脉穿刺结果作为最终诊断结果，孕妇无创DNA结果与介入性产前诊断结果比较，无创DNA检测准确率为66.28%，其中21三体检测准确率为82.93%，18三体检测准确率为100.00%，13三体、性染色体及其他染色体异常的检测准确率分别为66.67%、60.00%、14.29%。说明无创DNA对于21、18、13三体具有较高准确率，且其对21三体综合征、18三体综合征的检测准确率高于13三体、性染色体异常，因此能够更为准确的对其进行诊断，减少了误诊和漏诊的风险。高龄组、唐氏高风险组、其它高危因素组孕妇无创DNA阳性准确率分别为62.86%、72.73%、65.52%，三组准确率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明无创DNA对于不同风险等级的孕妇，其检测准确率无明显差异，因此具有很高的临床应用价值。

本研究中，胎儿染色体异常以21三体综合征为主，无创DNA对于胎儿染色体非整倍体异常具有较高的准确率，但无创DNA结果提示的各项高风险也存在假阳性结果，准确率并非均达99%以上。与其他学者报道是一致。据报道局限胎盘嵌合型是导致假阳性重要原因，孕妇自身染色体异常、母体实体肿瘤等、胎儿游离DNA不足等都可能导致无创结果假阳性[15-16]。本研究中18三体检测准确率最高，为100.00%.21三体检测准确率为82.93%，分析21三体准确率较实际临床低的原因：病例数仍需增加;临床中很多无创DNA结果示21三体高风险，且超声也提示异常的，孕妇拒绝进一步产前诊断，已自行引产。由于无创DNA检测结果假阳性的存在，无创检测结果阳性，不能直接终止妊娠，应建议其进一步行介入性产前诊断确诊。

本研究中12例无创DNA提示染色体微缺失及微重复的，产前诊断结果提示2例胎儿的染色体及Array-CGH结果异常。可见无创基因对亚显微的染色体微缺失、微重复存在一定的检出率。随着测序的加深，将可能发现更多类似病例。对于无创结果怀疑染色体微缺失、微重复，建议同时行染色体核型分析及Array-CGH验证结果。

综上所述，无创DNA与传统的染色体核型比较具有快速、安全无创等优点，是产前筛查21、18、13三体综合征的有效方法，对于其它染色体异常具有重要提示意义，患者接受度高，适于临床推广应用。但无创DNA存在假阳性，对其他染色体疾病检测准确性还需进一步提高。因此对于无创DNA检测结果提示高风险的孕妇，不能直接终止妊娠，应建议其进一步行介入性产前诊断确诊。

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（收稿日期：2019-04-19）