不同基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统对链球菌鉴定性能的比较*

胡 靓，张 旻，刘冬梅，吴文娟△

(1.同济大学附属东方医院南院检验科，上海 200123；2.重庆医科大学附属南川人民医院检验科，重庆 408400)

链球菌属是临床常见的重要致病菌，根据在哥伦比亚血琼脂平板上生长时的溶血情况，可分为α溶血链球菌、β溶血链球菌和γ溶血链球菌。肺炎链球菌属于草绿色链球菌群中的α溶血链球菌，由于与缓症链球菌、口腔链球菌等同属于缓症链球菌群，这些菌在进化关系上紧密，许多表型和分子特征相似，导致临床难以鉴定。目前，国内绝大多数临床微生物实验室链球菌属菌种的鉴定仍然基于微生物生物化学反应原理及VITEK 2 Compact的进行鉴定，常出现误判[1]。

20世纪80年代末，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOP MS)技术的出现，给临床微生物检验领域的发展打开了新的局面，通常只需要几分钟，可实现微生物的快速鉴定[2-5]，大大缩短了检测时间。质谱鉴定方法与传统生化鉴定方法相比具有简便、快速、准确等优点，大大提高了临床实验室工作对感染性疾病的诊断效率，为疾病诊断和及时治疗提供了更准确的实验室依据。为了评估MALDI-TOF MS对链球菌属临床菌株的鉴定能力，本研究对VITEK MS系统、Bruker Biotyper系统及Autof MS1000型质谱仪临床分离链球菌属细菌的鉴定能力进行比对分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 菌株来源：研究菌株为2015年1月至2019年8月同济大学附属东方医院临床分离的134株链球菌，覆盖13个种。另外，本研究纳入了Autof MS1000型质谱仪校准菌株ATCC 25922大肠埃希菌；VITEK MS质谱鉴定系统校准菌株ATCC 8379大肠埃希菌；Bruker Biotyper系统校准菌株ATCC 25922大肠埃希菌，并使用临床常用菌株ATCC 49619肺炎链球菌作为质控菌株，质控菌株均购自上海市临检中心。

1.2试剂与仪器 哥伦比亚血平板购自中国上海科玛嘉公司；基因组提取试剂盒购自中国天根生化科技有限公司；PCR仪器购自美国Bio-Rad公司；MALDI-TOF MS使用基质分别购自法国生物梅里埃公司、德国布鲁克道尔顿公司及河南郑州安图公司，按照各自试剂配制要求进行配制；Autof MS1000型质谱仪购自中国安图生物公司；VITEK MS质谱鉴定系统购自法国梅里埃公司；Bruker Biotyper系统购自德国布鲁克公司。

1.3方法

1.3.1复苏培养 所有入组菌株转种哥伦比亚血平板35 ℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，进行复苏后，挑取单菌落再次转种于哥伦比亚血平板进行纯培养35 ℃，5%CO2孵育24 h。

1.3.2研究设计 采用直接涂抹法平行使用3套质谱系统对研究菌株进行菌种鉴定。即取少量纯培养菌直接涂抹于靶板，滴加1 μL甲酸待干后，再滴加1 μL基质液，干燥后上机采集图谱并鉴定分析。使用16S rRNA基因片段测序比对的方法鉴定各菌种。取生长良好链球菌菌株按照基因组提取试剂盒操作步骤提取基因组。PCR扩增各菌种的16S rRNA基因，50 μL反应体系为：脱氧核苷酸 5 μL，引物Primer F 1 μL，引物Primer 1 μL DNA模板提取液 5 μL，2×PCR MIX 25 μL。16S rRNA-F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，16S rRNA-R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T，扩增片段1 500 bp。扩增参数：94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min循环30次，最后72 ℃延伸5 min，凝胶电泳后，在1 500 bp出现条带的送至中国上海赛音生物有限公司进行测序，测序结果上传数据库(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，确定菌种类型[6-7]。以PCR扩增产物对16S rRNA基因测序作为鉴定结果“金标准”，评价3套质谱系统鉴定结果的准确性。

1.3.3结果判定 根据产品使用说明，Autof MS 1000型质谱仪分值9.5～10.0为种水平置信，可能的亚种；分值9.0～<9.5为种水平置信；分值6.0～<9.0为属水平置信；<6.0为不可置信。VITEK MS质谱鉴定系统使用百分比(可信值)作为标本图谱与标准图谱一致性的判断标准，一致性60.0%～99.9%表示可信的鉴定结果；若一致性<60.0%，即无法给出可靠的鉴定结果；Bruker Biotyper系统分值2.3～3.0为高置信的种水平鉴定； 2.0～<2.3为确定的属水平鉴定，可能的种水平鉴定；分值1.7～<2.0为可能的属水平鉴定；分值0.0～<1.7为不可靠的鉴定。

2 结 果

2.116S rRNA及质谱鉴定结果 通过PCR扩增16S rRNA基因，测序比对临床分离的链球菌株。3套质谱鉴定系统对无乳链球菌、化脓链球菌、解没食子酸链球菌、戈登链球菌及变异链球菌的准确鉴定率均为100%。见表1。

2.2VITEK MS质谱鉴定系统鉴定结果 检出率为94.03%(126/134)，准确率为89.55%(120/134)，其中14株星座链球菌未能鉴定到亚种，7株缓症链球菌鉴定为缓症链球菌/口腔链球菌，1株肺炎链球菌鉴定为解没食子酸链球菌，1株咽峡炎链球菌鉴定为血链球菌，1株马肠链球菌鉴定为婴儿链球菌，2株咽峡炎链球菌分别鉴定为星座链球菌和肺炎链球菌，1株唾液链球菌鉴定为前庭链球菌。见表1。

表1 16S rRNA基因测序和3种质谱方法对链球菌鉴定结果

2.3Autof MS1000型质谱仪鉴定结果 检出率为100.00%(134/134)，准确率为94.78%(127/134)，其中21株停乳链球菌及14株星座链球菌未能鉴定到亚种，5株缓症链球菌鉴定为口腔链球菌，1株肺炎链球菌鉴定为解没食子酸链球菌，1株咽峡炎链球菌鉴定为血链球菌。见表1。

2.4Bruker Biotyper系统鉴定结果 检出率为100.00%(134/134)，准确率为94.78%(127/134)，其中21株停乳链球菌和14株星座链球菌未能鉴定到亚种，5株缓症链球菌鉴定为口腔链球菌，1株肺炎链球菌鉴定为解没食子酸链球菌，1株咽峡炎链球菌鉴定为血链球菌。见表1。

2.5检测系统间比较 由于Autof MS1000型质谱仪和Bruker Biotyper系统的检出率和准确率相近，故对2套系统的鉴定得分进一步研究，结果显示Autof MS1000型质谱仪可鉴定至种水平置信及可能的亚种占94.03%，鉴定至种水平置信占0.75%，误鉴定占5.22%；Bruker Biotyper系统可鉴定至高置信的种水平占38.06%，鉴定至确定的属水平鉴定及可能的种水平鉴定占55.22%，鉴定至可能的属水平鉴定占1.50%，误鉴定占5.22%。Autof MS1000型质谱仪准确鉴定链球菌种水平能力明显高于Bruker Biotyper系统，而这2种检测系统均不能鉴定停乳链球菌亚种，VITEK MS质谱可鉴别停乳链球菌停乳亚种和似马亚种。见表2。

表2 Autof MS1000及Bruker Biotyper检测分值比较

注：-表示此项无数据。

3 讨 论

MALDI-TOF MS 技术能够检测蛋白质、核酸等生物大分子，自该技术出现至今，其在医学、生物领域的应用愈加广泛[8-9]。在医学上，MALDI-TOF MS因其操作简便、快速等优点，可协助临床医生进行快速诊断与治疗，优化患者预后[10-11]。

临床中肺炎链球菌和无乳链球菌是常见的致病菌，肺炎链球菌能引起包括肺炎在内的菌血症、脑膜炎和急性中耳炎等疾病，无乳链球菌是能引起孕妇产褥期脓毒血症和新生儿脑膜炎的一个重要原因，可引起产后感染、菌血症、心内膜炎、皮肤和软组织感染及骨髓炎。因此，能准确鉴定对诊断具有重要意义[12-13]。传统链球菌鉴定方法为根据菌落形态和溶血情况进行初筛，再进行生化反应、杆菌肽试验、CAMP试验、API 20 Strep或VITEK 2等细菌鉴定仪器确定菌种种类，但这些方法有时难以将菌种准确区分，且耗时长[14-15]。通过将上述这些方法及测序方法与MALDI-TOF MS进行比较，不少研究证明后者在链球菌鉴定方面具有较高的一致性和应用价值[16-22]。

随着不同质谱系统的出现，对其进行系统间的链球菌属鉴定能力评估也显得愈加重要。国内外分别有研究报道，VITEK MS对链球菌的鉴定能力稍强于Bruker Biotyper[23-24]。在前人研究基础上，本研究使用16S rRNA测序鉴定134株链球菌结果为“金标准”，评估VITEK MS、Bruker Biotyper和Autof MS1000质谱鉴定系统对链球菌属的鉴定能力。与前人研究相似，3套质谱系统均能很好地鉴定化脓链球菌和无乳链球菌等大部分链球菌菌种(准确率100.00%)。其次，已有报道说明VITEK MS和Bruker Biotyper系统易将缓症链球菌鉴定为缓症链球菌/口腔链球菌，且对肺炎链球菌鉴定准确率有待提高，本研究也得出相似结果，并显示Autof MS1000也存在相似的问题(本研究中3套质谱系统对肺炎链球菌准确率分别94.73%、78.94%、94.73%)。这提示有待寻找这些链球菌种中更多的质谱特异峰，来进一步提高鉴定的准确率[20]。

同时，本研究显示，3套质谱系统仍然存在无法鉴定或不能准确区分亚种的情况，如VITEK MS质谱鉴定系统有5.97%菌株无法鉴定，3套系统均无法鉴定星座链球菌星座亚种，Autof MS1000型质谱仪及Bruker Biotyper系统无法鉴定停乳链球菌似马亚种、VITEK MS质谱鉴定系统将21株停乳链球菌似马亚种中9株鉴定为停乳链球菌停乳亚种且有3株无鉴定结果。MALDI-TOF MS鉴定的覆盖率和准确率依赖于较完善的质谱菌种鉴定数据库的建立，数据库中图谱的质量、数量都将直接影响鉴定的成功率与准确率[25-26]。笔者建议3套质谱系统在数据库更新建库时，入组更多的星座链球菌及停乳链球菌不同亚种，以优化数据库，提高鉴定成功率与准确率，更好地服务于临床。

当然，本研究亦存在不足之处，即菌种数量分布不均匀，后续可进行多中心实验，扩大标本量，进行进一步研究。

4 结 论

综上所述，链球菌是临床重要的病原菌，本研究结果显示VITEK MS、Bruker Biotyper和Autof MS1000对无乳链球菌、化脓链球菌可准确鉴定、直接报告；但是对一些种类菌株鉴定结果有误或不能鉴别亚种，需要DNA序列分析或结合血清学或其他补充实验来准确鉴定。同时，有待对某些链球菌菌种亚种的质谱数据库进行优化补充，探索更多的菌种特异性质谱峰，以进一步提高鉴定成功率和准确率。