洋葱蛋白及多肽的制备及其体外抗氧化活性评价

赵 璇

(河北化工医药职业技术学院,石家庄 050026)

洋葱(Alliumcepa)，又名球葱、玉葱等，系百合科葱属二年生草本植物[1]。因其具有丰富的营养成分、宝贵的药用价值和特殊的气味，受到消费者的喜爱和研究者的青睐，还被誉为“蔬菜皇后”。洋葱的主要活性成分有蒜素类化合物、甾体皂苷、类黄酮类物质等，很多都具有抗氧化、抗肿瘤的功效，同时中医医学认为洋葱味甘且辛，性平，可以调理肠胃[2]。

近年来，生物活性肽，尤其是抗氧化肽受到了广泛关注。研究表明[3，4]，抗氧化肽能有效地清除体内多余的自由基，进而保护细胞不受损伤，维持细胞正常机能。但是现有报道几乎集中在了动物蛋白和大豆蛋白上，蔬菜类蛋白质及多肽的抗氧化性能却少有报道[5，6]。洋葱蛋白质虽然并不高(1.8%左右)，但是已有报道说明洋葱蛋白及其水解产物具有抗氧化的性质，但是这方面的报道还是较少，多肽的制备和纯化过程也并不明晰，故本实验对洋葱蛋白的提取、洋葱多肽的制备和性质进行了较为系统的研究，为洋葱的高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

洋葱：购于河北省石家庄市某菜市场；木瓜蛋白酶(5×105U/g)：南宁庞博生物工程有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

电热恒温水浴锅 国华电器有限公司；精密电动搅拌器 常州丹瑞有限公司；2300 自动凯氏定氮仪 瑞士FOSS 公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 洋葱蛋白(Protein)的制备

洋葱剁碎后按照料液比1∶5(质量比)加入蒸馏水，磁力搅拌2 h后在4 ℃冰箱静置过夜，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节该溶液的pH至10.0，超声辅助提取20 min后以6000 r/min的转速、4 ℃的温度离心20 min，取上清液。用1 mol/L盐酸溶液调节该上清液的pH至4.0，于4 ℃冰箱静置沉淀5 h后以8000 r/min的转速、4 ℃的温度离心10 min，弃上清，取沉淀。沉淀水洗至中性，将其冷冻干燥72 h则为洋葱蛋白。

1.3 粗洋葱多肽(P)的制备

称取一定量上述洋葱蛋白，按料液比1∶4(质量比)加入蒸馏水和1600 U/g蛋白质的木瓜蛋白酶，45 ℃恒温水浴2，4，6，8 h，水解结束后于95 ℃水浴灭酶10 min，即为蛋白解液，将酶解液冷冻干燥72 h则为粗洋葱多肽(分别为P-2、P-4、P-6、P-8)[7]。

1.4 粗洋葱多肽水解度(DH)的测定[8]

DH(%)=[带鱼糜水解液氨基氮(mg/g)-带鱼糜溶液水解前氨基氮(mg/g)]/带鱼糜原料全氮(mg/g)×100。

式中：氨基氮含量的测定采用甲醛电位滴定法；全氮含量的测定采用凯氏定氮法。

1.5 粗洋葱多肽分子量(Mw)分布测定[9]

在HPLC系统上使用凝胶过滤分析粗洋葱多肽的分子量分布。将冷冻干燥的粉末(5 mg)溶于30%乙腈缓冲液(1 mL，0.1% TFA)流动相中。用SuperdexTMPeptide 10/300 GL柱分离样品(50 μL)，其分离分子量范围为7000～100 Da的肽。使用的标准品是细胞色素c(Mw12400)、抑肽酶(Mw6500)、Vit B12(MW1355)，GSSG(MW613)和甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸(Mw189)。检测波长为220 nm，温度为室温。

1.6 洋葱蛋白、粗洋葱多肽氨基酸组分测定[10]

称取一定量样品，加入6 mol/L HCl(含有1%苯酚)，在105 ℃水解24 h，定容，成水解液。吸取20 mL上述水解液真空干燥，样品衍生，再次进行干燥。将样品稀释液与干燥样品混合溶解，以10000 r/min的转速、4 ℃的温度离心10 min，高效液相分析。色谱柱：PICO-TAG柱，长度150 mm；流动相A：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 6.6)；流动相B：60%乙腈溶液；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min。

1.7 膜超滤法分离纯化洋葱多肽[11]

将洋葱蛋白和洋葱多肽冻干粉溶于超纯水，用福林酚法测定蛋白质含量，调节溶液蛋白质浓度为30 mg/mL。分别用截留分子量为10，5，1 kDa超滤膜对洋葱多肽溶液进行分级分离。调节蠕动泵转速为200 r/min，超滤膜板出口压力为250 kPa。P-2、P-4、P-6、P-8均收集不同分子量范围的几个组分：P-1(Mw>10 kDa)、P-2(Mw=5～10 kDa)、P-3(Mw=1～5 kDa)和P-IV(Mw<1 kDa)。各组分多肽分别冷冻干燥72 h，即得洋葱多肽纯化组分。

1.8 清除DPPH·能力测定[12]

用超纯水将洋葱蛋白、粗洋葱多肽、纯化洋葱多肽都配制成5 mg/mL的溶液。用这个浓度的溶液测定DPPH·清除能力。参照文献方法，配制1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，取2 mL置于离心管中，加入2 mL上述蛋白/多肽溶液，漩涡混匀，25 ℃下静置避光反应30 min，在517 nm处测定混合溶液的吸光度值Ax。同时，无水乙醇在517 nm处的吸光度值为参比，记为A0。蛋白/多肽溶液本身在517 nm处的吸光度值为Ax0。

DPPH=[A0-(Ax- Ax0)]/A0×100%。

式中：A0为无水乙醇参比溶液的吸光度值；Ax为混合溶液的吸光度值；Ax0为蛋白/多肽溶液的本底吸光度值。

1.9 数据分析

将实验数据用SPSS 19.0、Origin 8.1进行分析。

2 结果与分析

2.1 粗洋葱多肽的水解度(DH)

在木瓜蛋白酶的作用下，洋葱蛋白质大分子逐渐被酶解成小分子多肽。水解度能够衡量水解的程度，反映酶的作用强度。洋葱蛋白水解度随水解时间的变化见图1。

图1 水解时间对水解度的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

由图1可知，随着水解时间的延长，水解度先急剧上升后缓慢上升趋于平稳。水解2 h后，水解度仅仅为12.6%；水解6 h基本达到平稳，水解度为47.6%；水解8 h变化不大，水解度为50.8%。故在工业化生产中，只需酶解6 h即可达到合适的水解度。

2.2 粗洋葱多肽分子量分布

合适分子量多肽的抗氧化性具有最好的效果，故有必要测定其分子量分布范围。以标品的保留时间为横坐标、分子量对数为纵坐标，做标准曲线，得y=5.61056-0.08286x，R2=0.99786，见图2。

图2 标品分子量与保留时间标准曲线Fig.2 Standard curve of molecular weight and retention time of standard product

由图2可知，该标准曲线的准确度较高，符合下一步要求，可利用该标准曲线测定多肽样品的分子量分布。对4种粗洋葱多肽液相样品图进行手动积分，并且以分子量6 kDa(22.11 min)、3 kDa(25.74 min)、1 kDa(31.50 min)、0.1 kDa(43.57 min)为分界线，得到以下分子量分布结果，见表1。

表1 粗洋葱多肽分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of crude onion peptides %

由表1可知，P-2水解度很低，几乎有一半的蛋白质在6 kDa以上，小于1 kDa的多肽仅仅占10%左右；随着水解时间的延长，可以看出分子量明显变小，P-6和P-8的小分子多肽的含量已经很高。

2.3 洋葱蛋白、粗洋葱多肽氨基酸组分

氨基酸的种类和比例很大程度上决定了多肽或蛋白的性质，包括其抗氧化性[13-15]。对洋葱蛋白和4种粗洋葱多肽的氨基酸组成进行了测定，结果见表2。

表2 洋葱蛋白、粗洋葱多肽氨基酸组分Table 2 Amino acid composition of onion protein and crude onion peptides

由表2可知，洋葱蛋白中谷氨酸含量较高，其他氨基酸的含量相当。洋葱蛋白酶解后，苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸等必需氨基酸含量有所上升，这提高了洋葱蛋白的营养价值，并且基本呈现出水解度越大提高越多的规律。根据文献[15]，蛋氨酸和半胱氨酸在抗氧化方面具有特别的效果，二者分别能够作为内源抗氧化剂和抵抗X-射线辐射，粗洋葱多肽中蛋氨酸和半胱氨酸显著提高，故抗氧化性可能有所提高。

2.4 洋葱多肽分离纯化

用不同截留分子量的超滤膜分离粗洋葱多肽，得到4种分子量组分，各组分质量含量见表3。与分子量分布结果相似，随着水解度的增大，P-I比例下降；P-II先下降再上升；P-III上升；P-IV上升。

表3 各样品的DPPH·清除能力和洋葱多肽纯化结果Table 3 DPPH · scavenging capacity and onion peptides' purification results of each sample

续 表

2.5 DPPH·清除能力

洋葱蛋白、粗洋葱多肽、纯化组分的DPPH·清除能力见表3。洋葱蛋白的DPPH·清除能力为42.44%；对于粗洋葱多肽，正如2.3部分的预测，随着水解度的增大，DPPH·清除能力先急剧增强后趋于平稳，最高能达到69.32%；对于纯化组分，可观察到P-III组分的DPPH·清除能力最强，这可能归功于其合适的分子量(Mw=1～5 kDa)[16]。有研究报道，分子量小的组分比分子量过大的组分抗氧化性更强，我们的结果与之相符[17]。

3 结论

利用碱提酸沉法提取洋葱蛋白，以木瓜蛋白酶酶解洋葱蛋白，得到粗洋葱多肽产物，酶解6 h，水解度基本达到最大值47.6%。与洋葱蛋白相比，粗洋葱多肽具有良好的DPPH·清除能力，并且与水解度成正比，最高能达到69.32%。将粗洋葱多肽进行膜超滤法分离纯化，得到4个分子量组分，在4种水解度的粗洋葱多肽中，P-III组分(Mw=1～5 kDa)的DPPH·清除能力均为最强，这归功于其合适的分子量分布。由氨基酸组成测定结果可知，粗洋葱多肽的必需氨基酸组分、支链氨基酸组分均有所提高，这很大程度上决定了DPPH·清除能力的提高。