长期笑气吸入对大鼠肝脏毒副作用的影响

孙培鸣，王 丽，孙宏伟，杨建武，赵晓波，张 瑾，杨鹤鸣＊，崔 彦

（1.战略支援部队特色医学中心 普通外科，北京 100101；2.中日友好医院 神经内科，北京 100029；3.清华大学第一附属医院 神经内科，北京 100016；4.战略支援部队特色医学中心 病理科，北京 100101）

笑气，即一氧化二氮（nitrous oxide，N2O），是室温下无色、稍带甜味的气体。笑气有轻微的麻醉作用，吸入后可使人丧失痛觉，感到欣快、发笑，甚至产生幻觉。临床上笑气常用作吸入性镇痛麻醉药物，较广泛用于外科、妇产科及口腔科等[1，2]。近年来，笑气在娱乐场所滥用[1～3]。目前国内外对笑气滥用危害的报道多集中于神经损伤领域，对肝脏毒副作用的研究未见相关报道。但在临床诊疗中我们发现部分患者的肝脏转氨酶明显增高，提示笑气有导致肝功能损伤的可能。本研究拟探讨长期笑气吸入对大鼠肝脏功能、细胞凋亡及组织学特点的影响，从而提高对笑气滥用危害的认识，并为其防治提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年（8 周龄）Wistar 雄性大鼠10 只，体重200～250g，购买自北京华阜生物科技有限公司，饲养于中日友好医院动物实验中心（SPF 级），自由进食水。本实验经中日友好医院研究伦理委员会审核批准，实验过程符合动物实验研究管理规定。

1.2 主要试剂及仪器

医用氧气及N2O （北京普莱克斯实用气体有限公司），一步法TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒（KGA7073，凯基生物），小动物氧浓度控制系统（动物染毒箱，上海玉研科学仪器有限公司）、倒置荧光显微镜及成像系统（Ci-S/ DS-U3，日本尼康公司）、全自动生化分析仪（7180，日本日立公司）、正置显微镜BX51 及摄像头DP72 （日本Olympus公司）。

1.3 动物分组及笑气吸入实验

将Wistar 大鼠随机分为2 组：笑气暴露组及吸氧对照组，每组5 只，置于动物染毒箱内。笑气暴露组暴露在N2O 和O2（1：1）混合气体中，吸氧对照组暴露在氧气中，氧浓度控制在50%。2 组气流速度均为1.5L/min，吸入时间120min/d，连续60d。

1.4 大鼠肝功能检测

笑气连续吸入60d 后，自大鼠股静脉采集血液约2ml，离心10min（3000r/min），留取血清。采用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平，分析比较2 组大鼠肝功能变化。

1.5 大鼠肝细胞凋亡检测

实验结束后处死大鼠，选取肝脏左外叶组织，大小约1.5cm×1cm×0.2cm。采用TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒检测大鼠肝细胞凋亡。肝脏组织常规石蜡包埋、切片后，按照试剂盒步骤进行TUNEL 检测。然后利用倒置荧光显微镜观察并在200 倍视野下采集图像。利用ImageJ 软件，统计视野下细胞亮绿色光的光密度（IOD=IntDen/Area），每张切片统计3 个视野。比较分析2 组间肝细胞凋亡的差异。

1.6 大鼠肝脏组织学观察

常规石蜡包埋切片后HE 染色。利用正置显微镜观察肝脏的组织学结构特点，采集图像并比较分析2 组的差异。

图1 2 组大鼠肝功能检测结果的比较（n=5）

1.7 统计学方法

应用SPSS19.0 软件进行统计分析，做图软件采用Graphpad Prism 5。计量资料以±s 表示，2 组间比较采用t 检验。

2 结果

2.1 大鼠肝功能的改变

大鼠肝功能检测表明笑气暴露组ALT、AST的水平均高于吸氧对照组。图1 示，笑气暴露组及吸氧对照组大鼠ALT 检测值分别为：98.80±21.37U/L，74.40±6.07 U/L，2 组间差异有统计学意义（P=0.04）。

笑气暴露组及吸氧对照组大鼠AST 检测值分别为：270.20±44.24U/L，220.60±20.87U/L，2 组间差异无统计学意义（P=0.309）。

2.2 大鼠肝脏细胞凋亡的比较

TUNEL 检测结果（图2A、2B，见封二）显示大鼠肝细胞凋亡，2 组间差异无统计学意义。笑气暴露组大鼠肝脏细胞IOD 值为0.0486±0.0055，吸氧对照组为0.0338±0.0015。

2.3 大鼠肝脏组织学观察

显微镜下观察，与吸氧对照组（图3A，见封二）相比，笑气暴露组（图3B，见封二）大鼠肝脏组织学结构特点无明显改变。HE 染色显示2 组大鼠肝脏组织肝小叶结构正常，肝索以小叶静脉为轴心放射状排列，汇管区位于小叶周围，分布规律，均未见肝细胞变性坏死及炎症细胞浸润。

图2 2组大鼠肝细胞凋亡的比较。TUNEL检测结果显示笑气暴露组（图2A）和吸氧对照组（图2B）大鼠肝细胞的IOD值间无统计学差异（P=0.408）。图3 2组大鼠肝脏组织学特点比较（HE×200）。HE染色显示，与吸氧对照组（图3A）相比，笑气暴露组（图3B）大鼠肝脏组织学结构特点无明显改变。大鼠肝脏组织肝小叶结构正常，未见肝细胞变性坏死及炎症细胞浸润。

3 讨论

3.1 笑气滥用在国内外呈逐步增多趋势

18 世纪后期，Joseph Pruestly 首先认识并人工合成了N2O，随后Humphrey Davy 发现该气体能够使人感到欣快、发笑并丧失痛觉，故称之为“笑气”。因吸入后可以使人产生短暂的欣快感，从19 世纪开始笑气就被用于娱乐性消费并曾一度在欧洲上流社会圈非常流行。近年来，国内外的娱乐场所为了迎合青少年追求刺激的心态，将N2O 气体微型压缩装置（“笑气弹”或“whippets”）中的气体充入气球中吸食，以获得身体上的欣快感和迷幻效果[3]。2016年世界毒品调查报告显示，笑气已成为世界第七大流行滥用药物。文献报道在欧美等西方国家，笑气的使用人群约占29.4%～38.6%[4]。目前，小罐装笑气（8g/罐）在欧美等国家及地区的娱乐场所滥用。数据显示笑气滥用人群的平均年龄约在24.3 岁，其中青少年滥用率可达12%～20%，国内笑气滥用的病例报道也呈逐步增多趋势[1，5，6]。

3.2 笑气滥用对肝脏的毒副作用及机制尚不明确

笑气较为稳定，吸入后绝大部分以原药形式呼出体外，其余由皮肤蒸发，或排至尿道和肠道中，经肠道细菌的生物作用转化为亚硝酸盐和氮等[6]。笑气的扩散性较强，吸入后可导致肺泡内氧稀释，氧分压下降，引起弥漫性缺氧。研究表明，长期接触、滥用笑气可导致慢性中毒，包括贫血和神经系统损害等临床症状[7]。近年来国内外研究认为笑气导致的慢性中毒主要与其影响体内维生素B12（钴胺素）的代谢相关[8]。另一可能原因为笑气吸入导致的缺氧引起神经系统供氧不足，同时神经系统兴奋、耗氧增加，进一步加重了缺氧，进而导致神经系统损伤[9]。

目前国内外对笑气滥用危害的报道多集中于神经损伤领域，而对其肝脏毒副作用关注较少。肝脏是人体最重要的消化器官，具有合成、代谢及解毒等重要的生理功能。其解毒机制为外来或体内代谢过程中产生的有毒物质，在肝脏转变为无毒或溶解度大的物质，随胆汁或尿液排出体外，以保护机体、维持正常的生理功能[10]。笑气吸入对肝脏的毒副作用及机制尚不明确。综合国内外文献报道，多数笑气中毒患者的肝功能无异常，部分患者出现肝功能损伤，表现为转氨酶的升高，经对症治疗后可逐步恢复正常[11～13]。其可能的原因为，笑气中毒主要影响维生素B12的代谢，而肝脏是体内贮备维生素B12的主要器官，约占总量的80%～90%，在维生素的代谢中发挥重要作用[14]。因此肝脏可能为笑气吸入中毒潜在的神经系统外靶器官。另一方面，长期笑气吸入可导致缺氧。肝脏是高代谢、高耗氧器官，急慢性缺氧均可影响肝脏功能。研究表明，缺氧状态下肝细胞三羧酸循环抑制，无氧酵解代偿性增强，乳酸分泌增多，产生氧自由基，引起肝细胞变性甚至坏死[15]。另外缺氧也可导致肝细胞凋亡增加，引起肝功能损伤[16，17]。ALT 和AST 能敏感提示肝细胞损伤及其程度，其中ALT 主要反映急性肝细胞损伤，AST 主要反应肝细胞损伤程度。有文献指出，肝脏功能损伤可引起维生素B12的贮备障碍和释放增加，导致血清维生素B12水平升高[18]。这有可能是临床诊疗过程中，笑气中毒神经系统损伤患者的血清维生素B12水平正常或升高的原因之一。

3.3 笑气吸入可导致大鼠肝功能损伤

研究中我们利用小动物氧浓度控制系统 （动物染毒箱） 观察长期笑气吸入对大鼠肝脏的毒副作用及可能机制。结果显示：（1）大鼠肝功能损伤，表现为笑气暴露组ALT 和AST 的检测值均高于吸氧对照组，其中ALT 的升高有统计学差异；（2）大鼠肝细胞凋亡趋势增加，TUNEL 检测结果显示笑气暴露组大鼠肝细胞凋亡值高于吸氧对照组，但两者相比无统计学意义；（3）大鼠肝脏组织学特点变化不明显，HE 染色未见明确病理学改变。综合实验结果分析，长期笑气吸入对肝脏毒副作用为导致肝功能损伤，引起肝细胞凋亡趋势增加，但并未导致肝细胞变性或坏死等组织病理学改变。且从转氨酶数据分析，笑气对肝脏毒副作用为急性肝损伤，肝细胞损伤程度并不严重。故临床上笑气中毒导致神经系统损伤合并肝功能损伤的患者经保肝药物等对症治疗后，肝功能可恢复正常。同时因肝脏有较强的代偿功能，若肝功能损伤在其代偿范围之内，肝脏转氨酶可不出现异常。这可能是多数笑气中毒神经系统损伤患者肝功能正常的原因。有关笑气引起肝功能损伤和神经损伤之间的关系，笑气引起肝功能损伤、肝细胞凋亡趋势增加的机制及两者之间的关系尚不明确，有待于进一步研究。本实验的不足之处为没有观察肝细胞超微结构的改变，如线粒体等细胞器。样本量较偏少，仍需大样本实验加以验证。

综上所述，我们的实验结果提示，在长期笑气吸入患者的临床诊治中应警惕肝功能损伤的可能，加强对肝功能的监测和保护。