补肾活血方调节COX-2、PGE2改善不明原因复发性流产患者分泌晚期蜕膜化水平的研究

冯晓玲，朱慧，常卓，张扬，蒋莎，谷玥儒，贾紫千，吴仪

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指与同一性伴侣妊娠20周前，连续发生2次或2次以上的自然流产。其发病机制较为复杂，排除已知的病因，如解剖学因素、遗传因素、免疫因素、内分泌因素和感染因素等，仍有近40%～60%RSA是病因未知的，被称为不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[1-2]。近年来有研究认为，RSA的发病与子宫内膜的蜕膜化缺陷相关[3]。蜕膜化是月经发生的前提，在正常月经周期第23～24天时，子宫内膜间质细胞开始蜕膜化，于月经周期第28天蜕膜化基本完成由间质细胞向蜕膜基质细胞的转化。蜕膜化过程顺利是胚胎植入、胎盘形成及妊娠维持的必备条件[4]。催乳素(Prolactin，PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(Insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1)是衡量子宫内膜蜕膜化水平的重要指标，可调控子宫内膜上皮的分化及胚胎滋养层细胞的功能，防止受精卵氧化，以维持妊娠[5]。环氧合酶-2(COX-2)表达于着床前胚胎的滋养外胚层细胞，能调控花生四烯酸产生前列腺素E2(PGE2)[6]。研究表明，两者均参与妊娠早期子宫内膜蜕膜化和胚胎植入过程，影响胚胎着床、发育直至分娩，对女性生殖起到重要调控作用[7]。本文研究旨在明确URSA患者中COX-2、PGE2、蜕膜化水平的变化，并探索补肾活血方对URSA分泌晚期COX-2、PGE2、PRL及IGFBP-1水平的影响，从而在分子层面探究补肾活血方治疗URSA的作用机制，为URSA疾病的病因学研究提供新思路，并对URSA疾病的临床防治具有一定指导意义，值得推广应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年3月—2019年2月在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊及住院部治疗的符合纳入标准的肾虚血瘀型URSA患者共110例，其中现妊娠失败需行清宫术患者 15 例(试验组1)，正常妊娠要求行人工流产术者 15 例(对照组1)，共收集蜕膜样本 30 例。试验组1年龄平均(32.33±4.74)岁，孕周平均(9.30±1.75)周，对照组1年龄平均(33.80±3.74)岁，孕周平均(8.48±1.44)周，两组受试者停经周数、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。未孕患者80例(数字随机法平均分为2组：试验组2给予补肾活血方，对照组2给予阿司匹林)。其中试验组2排除5例，对照组2排除20例，未计入统计数据。试验组2和对照组2年龄平均(30.75±4.02)岁，另选取正常未孕女性40例(空白组),空白组年龄平均(33.8±3.74)岁，各组受试者年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入、排除、脱落、剔除标准见参考文献[8]。本实验已获得黑龙江中医药大学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

DEPC原液(广州市蓝博生物技术有限公司);TRLZOL Reagents(美国Invitrogen公司);无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司);三氯甲烷(天津市博迪化工有限公司);异丙醇(天津市富宇精细化工有限公司);Human COX-2 Elisa kit试剂盒、Human PGE2 Elisa kit 试剂盒、Human IGFBP-1 Elisa kit试剂盒、Human PRL Elisa kit试剂盒等(碧云天生物公司)。

1.3 主要仪器

高速组织匀浆器T1000(德国IKA公司)；高速冷冻离心机(美国BECKMANCOULTER 公司、型号：Alegra 21R);罗氏实时定量 PCR 仪(美国 ThermoFisher Scientific公司);全自动酶标仪(BioTek Instruments.Inc，型号：ELX808);318W型洗板机(上海三科仪器有限公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 RT-PCR法检测蜕膜中COX2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA

收集蜕膜，立即用无菌生理盐水冲洗，用无菌剪刀剪去血块，放入无菌器皿中，使用液氮迅速冷冻，放置在实验室-80℃冰箱中保存。

提取RNA(在冰上进行)并测定纯度。反转录严格按照美国 Thermo Scientific公司的反转录试剂盒说明书进行。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(PGE2：F 5'ATGGGACCTCCAAGCTCTTAG3'，R 5'GGAAGTTTGTGTTGCATCTTGTGT3'。COX-2：F 5'AGCAGGCAGATGAAATACCAGTCT3'，R 5'ATACAGCTCCACAGCATCGATGT3'。PRL：F 5'ATGGAAGTCCCGACCAGAC3'，R 5'ATTGAGGAGCAAACCAAACG3'。IGFBP-1：F 5'CTGCGTGCAGGAGTCTGA3'，R 5'CCCAAAGGATGGAATGATCC3'。GAPDH：F 5'ACAGTCAGCCGCATCTTC3'，R 5'CTCCGACCTTCACCTTCC3')。使用BIOTOOL的2x SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒，反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，40Cycles；60 ℃，30 s。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线。通过比较Ct方法定量结果，并且靶基因的相对表达量用2-ΔΔCt表示。

1.4.2 ELISA法检测血清COX2、PGE2、PRL、IGFBP-1水平

试验组2、对照组2和空白组入组后月经第26天抽取静脉血，分离血清后冻存备用，随即试验组2给予补肾活血方(丹参15 g，桑寄生15 g，菟丝子15 g，黄芪15 g，续断15 g，阿胶10 g)，每日100 mL水煎服，早晚分服(中药汤剂由黑龙江中医药大学附属第一医院中药局和煎药室提供)。对照组2给予阿司匹林，100 mg/日口服(意大利Bayer S.p.A.公司)。4周后再次留取静脉血，分离血清冻存。

常温解冻血清，标记10孔的标准品于酶标板上，稀释浓度分别为：90，60，30，15，7.5 U/L(COX-2试剂盒)；360，240，120，60，30 ng/mL(PGE2试剂盒)；18，12，6，3，1.5 ng/mL(PRL试剂盒)；18，12，6，3，1.5 ng/mL(IGFBP -1试剂盒)。加入需测定样品10 μL，37 ℃温育30 min；弃去酶标板中的液体，晾干，而后将洗涤液加入所有孔中，静置30 s，弃液，重复5次；在样品孔中加入50 μL的酶标试剂，用移液器重复吹打多次直至其混合均匀，重复温育、洗涤；将50 μL的显色剂A、B依次加入微孔中，混合均匀，避光，37 ℃条件下显色15 min；于每个微孔中加入 50 μL终止液终止反应；使用ELX808全自动酶标仪，在450 nm波长条件下，依照次序测量每个微孔的OD值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 蜕膜组织中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA 水平比较

试验组1蜕膜组织中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA水平均低于对照组1，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1 试验组1和对照组1蜕膜组织中 COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1的mRNA水平比较

2.2 血清中COX-2、PGE2、PRL、IGFBP-1水平比较

治疗前试验组2和对照组2血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；试验组2治疗后血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平表达与治疗前相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后试验组2血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平高于对照组2，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。治疗后试验组2和对照组2相比血清COX2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平更接近于空白组(见图1)。

表2 试验组2和对照组2血清COX-2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比较

图1 各组血清COX-2、PGE2、PRL和IGFBP-1水平比较

2.3 COX-2、PGE2与蜕膜化因子PRL、IGFBP-1相关性

COX-2、PGE2与蜕膜化因子PRL、IGFBP-1之间存在显著且有统计学意义的相关性(P<0.05，见表3)。

表3 COX-2、PGE2与蜕膜化因子PRL、IGFBP-1相关性比较

3 讨论

复发性流产为当代育龄期女性常见疾病，且其发病率呈逐年上升趋势，严重影响女性身心健康。复发性流产病因、病机复杂，包括夫妻双方及胚胎染色体异常、内分泌失调、免疫因素、胚胎种植部位及生殖道结构异常、生殖道感染、血栓前状态等因素相关[9]。子宫内膜蜕膜化是指子宫内膜基质细胞受到蜕膜化诱导因子的刺激，使子宫内膜增殖分化成特殊组织，有利于胚胎的植入及胎盘的形成，是维持妊娠的必须条件[10]。女性子宫内膜的周期性改变是先天性的生物学特征，同理处于这种循环中的重要一节的蜕膜化改变属于自动发生的，与女性是否受孕无关；子宫内膜蜕膜化后的发展可分为2种：若女性未受孕，蜕膜化的内膜由于黄体的萎缩导致的激素水平突然降低而出现的撤退性出血，月经期过后，子宫内膜立即进入下一个周期；若卵子与精子成功结合，女性受孕，则蜕膜化的内膜继续增殖和分泌，为接下来的胚胎植入和胎盘发育做准备，形成母胎界面中母体面的主要成分；有研究人员认为，子宫内膜蜕膜化是早孕是否成功的关键因素之一[11]。子宫内膜蜕膜化对女性妊娠有着至关重要的作用，如杨慧等人通过体外诱导正常人和RSA患者内膜基质细胞蜕膜化进行对比研究，它们认为复发性自然流产的发生发展的重要原因，即蜕膜化异常[12]。目前，PRL及IGFBP-1已被广泛认可为衡量蜕膜化水平的标志性指标[13]。PRL由垂体分泌，作用于妊娠黄体，一定量的PRL，能促进子宫内膜蜕膜化形成，增加子宫内膜容受性，避免母胎排斥，是维持妊娠的关键。同时，PRL也是蜕膜化的产物，分化良好的蜕膜基质细胞又可以分泌更多的PRL，维持妊娠[14]。IGFBP-1是分泌期子宫内膜的产物，在蜕膜化基质细胞中表达[15]，调控子宫内膜基底细胞有丝分裂，既作为蜕膜化产物，又可促进和维持蜕膜化水平。

环氧合酶COX是参与前列腺素及其衍生物合成的重要限速酶，包括COX-1、COX-2和COX-3同工酶，其中COX-2的表达对胚胎的种植及蜕膜化起到促进作用，其水平随着滋养细胞的侵入不断增加，因此COX-2的高表达是维持妊娠的重要条件。COX-2属于诱导型，是一种即刻早期反应基因，在多数组织中不体现，活性较为稳定，但在一些应激刺激条件下活性度增高，产生一系列反应物质参与人体生理或病理活动[16]；如通过COX-2缺陷雌性小鼠的实验发现，COX-2表达异常会引起排卵障碍、蜕膜化不完全、胚胎着床失败和复发性流产等疾病[17]。COX-2催化花生四希酸产生的PGE2，可促进胚胎种植部位血管再生及局部血流量增加[18-19]。前列腺素广泛存在于人体多种组织中，如卵巢、子宫、肝脏、血小板、红细胞等，并且不同器官中不同时期前列腺素的功能不同，且在分泌晚期PGE2及其信号通路上游物质COX-2含量显著增加[20]；PGE2是调节子宫肌肉收缩的有效刺激物，若PGE2表达异常会导致子宫收缩调节失衡，继而异常子宫出血、痛经、不孕症、复发性流产等疾病出现的可能性增加[21]；于浩等人认为COX-2是子宫内膜蜕膜化进程中的关键影响因素[22]；COX-2催化出的PGE2能够增加子宫内膜血管通透性，参与蜕膜化的过程[23]。纪蓓蓓等人发现，在未孕女性外周血清中可测得PGE2，并可作为差异性比价的标准，且未孕女性外周血中PGE2浓度与孕期女性相比有明显差异[24]。有研究报告称，在反复妊娠失败的着床期子宫内膜中监测出COX-2，并与流产密切相关[25]。试验结果显示肾虚血瘀型不明原因复发性流产患者的流产蜕膜组织中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL的表达水平较正常女性低；COX-2、PGE2与蜕膜化因子PRL、IGFBP-1之间存在显著且有统计学意义的相关性，证实了URSA患者的低蜕膜化水平与COX-2、PGE2的低表达相关，推测两者变化可能会影响蜕膜化水平。

中医将URSA归属于“滑胎”范畴，肾为先天之本，主藏精气，可固摄胎元，肾虚为滑胎的根本，肾虚冲任不固，系胎无力，则屡孕屡堕。血瘀则胞脉气血运行不畅，瘀血阻滞，新血不能下注胞胎而胎失所养、胎元不实。在子宫内膜蜕膜化过程中，经常观察到大量的血管重塑，细胞增殖和分化，以及分泌的突然增加等[5]。现代研究认为肾虚血瘀型URSA为血栓前状态所致，引起蜕膜及胎盘微血栓形成，影响胎盘血供，形成绒毛膜后或蜕膜下血肿，刺激子宫收缩而诱发流产[26]。补肾活血方具有促进血液流通，维持分泌功能，防止免疫异常导致的损伤；补充肾气，促进气血流通，改善血瘀状态；促进蜕膜化的正常进展，推动其生长发展，维持子宫环境的平衡，抑制针对胎儿的母体免疫排斥[27]。西医多应用阿司匹林抗血栓形成，对其用于治疗URSA仍存在争议。中医认为URSA患者多以肾虚为本，血瘀为标，治则以补肾祛瘀，活血安胎为主。补肾活血方：丹参15 g，桑寄生15 g，菟丝子15 g，黄芪15 g，续断15 g，阿胶(烊化)10 g。方中丹参，活血祛瘀，具有抗血栓、改善微循环的作用；菟丝子、续断、桑寄生，补肾安胎, 可调节生殖系统、抑制宫缩、抗凝血等；黄芪、阿胶补气养血，促进血液流通。观察结果显示，补肾活血方治疗后，肾虚血瘀型不明原因复发性流产未孕患者分泌晚期血清中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL表达水平较入组时显著提高，与正常女性相比无明显差别。

综上所述，同正常女性相比URSA患者蜕膜化水平较低，可能与COX-2、PGE2表达异常降低有关。补肾活血方体内干预可在未孕时提高血清中COX-2、PGE2、IGFBP-1、PRL水平，改善蜕膜化进程，提高蜕膜化水平，从而达到补肾活血，祛瘀安胎的目的，利于妊娠的维持。