藤茶提取物对素肉丸冷藏期间脂质和蛋白质氧化的抗氧化活性影响

张 煊，徐 玉，薛 海，姜国川，闫晓慧*，刘学军,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.吉林工商学院旅游学院，吉林 长春 130507；3.吉林工商学院财税学院，吉林 长春 130507）

食品在冷藏期间会发生氧化，导致其颜色、味道和质地均会发生变化，影响其品质[1-3]。食品腐败变质主要是由脂质和蛋白质氧化导致，而研究者普遍认为这两种类型的氧化主要通过自由基链反应发生[4-5]。因此，为了延缓食品的脂质氧化和蛋白质氧化，向食品中添加抗氧化剂十分必要。目前主要有两类抗氧化剂：1）合成抗氧化剂，如二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羟基茴香醚和叔丁基氢醌；2）天然抗氧化剂，如多酚、脂溶性维生素（生育酚和类胡萝卜素）、水溶性维生素（抗坏血酸）和黄酮类化合物等[6-7]。天然抗氧化剂由于其比合成抗氧化剂更健康和安全而成为热门研究对象。据报道，来自植物原料（如水果、蔬菜、草药、香料及其成分）的提取物是天然抗氧化剂的良好来源[8-9]。

藤茶（Ampelopsis grossedentata）为葡萄科蛇葡萄属[10]，俗称莓茶、端午茶、藤婆茶，广泛分布于中国南方[11]。藤茶中富含黄酮类物质，其中二氢杨梅素是藤茶黄酮的主要成分[12]。据先前的研究报道，藤茶提取物（vine tea extract，VTE）具有多种生物活性，如抗菌[13]、降血脂[14]、降血糖[15]、抗氧化[16-18]等，具有极高的经济价值和药用价值。此外，研究表明，VTE可以显著抑制脂质氧化。王文龙等[19]测定了VTE对猪油的抗氧化活性，结果表明，用VTE处理的猪油样品的过氧化值（peroxide value，POV）显著低于特丁基对苯二酚和对照组。Ye Liyun等[20]的研究表明，VTE可以显著抑制碎牛肉中硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的增加。大豆拉丝蛋白是一类新型休闲食品工业用原料，是以大豆分离蛋白为主要原料，经过特殊的工艺和设备，在可靠的操作系统控制下，生产出来的一种富含蛋白质且具有肌肉纤维结构的蛋白产品。大豆拉丝蛋白具有良好的咀嚼感，其氨基酸组成比例与人体所需的氨基酸比例接近，容易吸收利用，具有丰富的营养价值[21]。

目前，国内外对VTE的研究多集中在其有效成分提取和生物活性上，研究VTE对仿肉产品贮藏期间脂质氧化和蛋白质氧化的影响的报道很少。本实验以大豆拉丝蛋白为原料制作素肉丸，研究了VTE对素肉丸冷藏期间发生的脂质和蛋白质氧化的抗氧化效果，以期保持素肉丸贮藏过程中的品质和延长保质期。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆拉丝蛋白 河南品正食品科技有限公司。

藤茶、二氢杨梅素、2,4-二硝基苯肼、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 北京梦怡美生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UMC5斩拌机 德国Stephan公司；TMS-Pro质构仪美国FTC公司；ColorQuest XE-E色差仪 上海信联创作电子有限公司；HW.SY21-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LXJ-IIB离心机 上海安亭科学仪器厂；FD-80真空冷冻干燥机 北京博医康仪器有限公司；HB43-S快速水分测定仪 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；SS752-500脱水机 泰州市通江洗涤机械厂。

1.3 方法

1.3.1 素肉丸的制备

素肉丸制备的工艺流程为：大豆拉丝蛋白→浸泡→脱水→蒸汽漂烫→斩拌→乳化胚料制备→混合→风味调配→成型→油炸→真空包装→成品，操作要点如下。

1）选料：挑选黄色、片状完整的大豆拉丝蛋白原料；2）冷浸：将大豆拉丝蛋白于冷水中浸泡1 h，至无硬芯；3）冷冻：将泡至无硬芯后的大豆拉丝蛋白进行脱水，然后放在-20 ℃进行冷冻；4）脱水：将冷冻后的大豆拉丝蛋白原料置于室温下解冻，然后使用脱水机脱水5 min，去掉大豆拉丝蛋白原料表面的水分；5）蒸汽漂烫：用大小适中的盆盛适量的水，用电磁炉将水烧至煮沸，将湿润的大豆拉丝蛋白置于帘上，将产生豆腥味的湿润大豆拉丝蛋白与过热蒸汽接触，通过汽化除去游离的豆腥成分；6）乳化胚料的制备：以大豆拉丝蛋白湿质量为基准，加入20%面粉、20%变性淀粉和15%大豆分离蛋白，以及适量水和油制作乳化胚料；7）斩拌：将漂烫后的大豆拉丝蛋白用绞肉机绞碎，充分混合至均匀；8）风味调配：以大豆拉丝蛋白湿质量为基准，向胚料中加入3.17%食盐、2.2%白糖、2.01%味精、3.90%葱和3.22%生姜，搅拌均匀；9）成型：将大豆拉丝蛋白混合物手工搓成肉丸，肉丸直径2 cm；10）油炸：将油加热至270 ℃，将素肉丸下至锅里使肉丸熟制；11）真空包装：将冷却至室温的素肉丸用真空袋装好，进行真空包装。

1.3.2 VTE的制备

首先用粉碎机将藤茶粉碎，过60 目筛，然后用石油醚进行脱脂，脱脂后放入烘箱，40 ℃烘干。称取10 g脱脂后的藤茶粉末，在料液比1∶40、乙醇体积分数70%、提取温度为70 ℃的条件下回流提取1 h。然后将藤茶混合物用真空泵过滤，得到上清液，再用旋转蒸发仪浓缩，冻干得到VTE。以二氢杨梅素为标准物质，采用AlCl3比色法[22]测得VTE的黄酮质量分数为8.14%。

1.3.3 原料处理与分组

以不添加任何物质的素肉丸为空白对照，其他3 组中，分别在素肉丸中添加素肉丸质量的0.01% BHT（阳性对照）、0.1% VTE粉末、0.3% VTE粉末。然后将4 组样品装入透氧袋（乙烯-醋酸乙烯共聚物）中，在（4±1）℃的黑暗条件贮藏8 d，每隔2 d取样进行指标测定。

1.3.4 水分质量分数的测定

将样品切成小块，取3 g样品放至铝托盘上，用快速水分测定仪测定水分质量分数。

1.3.5 亮度的测定

采用用色差仪测定肉丸亮度L*值。

1.3.6 弹性的测定

将样品切成2 cmh2 cmh1 cm的小块，用质构仪测定样品的弹性，测定参数：形变量50%，检测速率120 mm/min，起始力0.8 N。

1.3.7 素肉丸脂质氧化指标的测定

1.3.7.1 POV的测定

参考GB 5009.227ü2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》的滴定法测定素肉丸的POV，以过氧化物相当于碘的含量表示，单位为g/100 g。

1.3.7.2 TBARS值的测定

参考GB 5009.181ü2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》中的分光光度法测定素肉丸的TBARS值，结果以每千克素肉丸中所含丙二醛的质量表示，单位为mg/kg。

1.3.8 素肉丸蛋白氧化指标的测定

1.3.8.1 羰基含量的测定

参考Oliver等[23]的方法测定素肉丸的羰基含量，结果以每毫克蛋白所含羰基物质的量表示，单位为nmol/mg。

1.3.8.2 巯基含量的测定

采用Ellman[24]的方法测定素肉丸中的巯基含量，结果以蛋白质量计，单位为nmol/mg。

1.4 数据统计与处理

采用SPSS 24.0软件进行数据统计，并用方差分析进行最小显著性差异法多重差异分析，P＜0.05表示差异显著。所有实验数据均为3 次重复实验结果的平均值。结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 VTE对素肉丸在冷藏期间理化性质的影响

2.1.1 水分质量分数的变化

表 1 VTE对素肉丸在冷藏期间水分质量分数的影响Table 1 Effect of VTE on moisture content of vegetarian meatballs during refrigerated storage%

如表1所示，所有组的初始水分质量分数没有显著差异（P＞0.05）。与冷藏0 d相比，冷藏8 d后所有组的水分质量分数均显著下降（P＜0.05），这可能是由于随着冷藏时间的延长，产品的水分蒸发。贮藏过程中添加VTE的素肉丸水分质量分数均显著高于空白对照组（P＜0.05），说明添加VTE可以有效抑制素肉丸的水分蒸发，保持其水分质量分数。

2.1.2L*值的变化

表 2 VTE对素肉丸在冷藏期间L*值的影响Table 2 Effect of VTE on L* value of vegetarian meatballs during refrigerated storage

颜色在消费者对素肉丸的接受度方面起着重要作用。如表2所示，经VTE处理的素肉丸初始L*值显著低于空白对照组（P＞0.05），这可能是VTE本身的颜色（绿色）导致的。在冷藏期间，所有组的L*值显著下降（P＜0.05）。但冷藏8 d时，经VTE处理的素肉丸L*值显著高于空白对照组（P＜0.05），说明VTE可以抑制素肉丸在贮藏过程中色泽的劣化。

2.1.3 弹性的变化

如表3所示，冷藏的前2 d内，所有组的弹性没有显著性差异（P＞0.05）。与贮藏初始（0 d）相比，冷藏8 d后所有组的弹性均显著下降（P＜0.05），但与空白对照组相比，经VTE处理的素肉丸具有更高的弹性（P＜0.05），甚至高于BHT处理组。说明VTE有利于保持素肉丸贮藏过程中的弹性。

表 3 VTE对素肉丸在冷藏期间弹性的影响Table 3 Effect of VTE on elasticity of vegetarian meatballs during refrigerated storage

2.2 VTE对素肉丸在冷藏期间脂质氧化和蛋白质氧化的影响

2.2.1 POV的变化

图 1 VTE对素肉丸在冷藏期间POV的影响Fig. 1 Effect of VTE on POV of vegetarian meatballs during refrigerated storage

POV是评估油脂初始氧化程度的一个指标。如图1所示，在冷藏0 d时，空白对照、0.01% BTH、0.1% VTE、0.3% VTE处理组的初始POV分别为1.84、1.75、1.72、1.64 g/100 g，且0.1% VTE和0.3% VTE处理组的POV显著低于空白对照组，说明VTE对素肉丸在冷藏初期就抑制了脂质氧化。当冷藏4 d时，空白对照组的POV达到了最大值，随后开始下降。这可能是由于在冷藏初期，素肉丸发生脂质氧化，在4 d时初级氧化结束；4 d后，形成的氢过氧化物分解成二级脂质氧化产物，导致POV下降[25]。在冷藏的0～4 d，0.1% VTE和0.3% VTE组POV变化不显著（P＞0.05）；冷藏4～6 d过程中，POV略有增加。以上说明0.1% VTE和0.3% VTE组素肉丸的初始氧化非常缓慢。在冷藏0～6 d时，0.1% VTE组和0.3% VTE组的POV显著低于空白对照组（P＜0.05），说明VTE可以显著抑制素肉丸的脂质氧化。贮藏8 d后，两个VTE组的POV显著高于空白对照组，说明VTE组的素肉丸形成的氢过氧化物降解缓慢，进一步说明VTE延缓了脂质氧化。此外，0.1%、0.3% VTE抑制脂质氧化的作用强于0.01% BHT。

2.2.2 TBARS值的变化

如图2所示，在冷藏0～2 d的过程中，所有组的TBARS值没有显著性变化（P＞0.05）。与初始TBARS值相比，冷藏8 d后所有组素肉丸的TBARS值显著增加（P＜0.05），但在冷藏的第8天，经VTE处理的素肉丸的TBARS值显著低于空白对照组（P＜0.05），且VTE和BHT处理组之间没有显著差异（P＞0.05）。有研究表明，与空白对照组相比，二氢杨梅素和VTE均能显著降低熟牛肉贮藏过程中的TBARS值[20]。本课题组已通过气相色谱-质谱联用分析了VTE的化学组成，VTE主要由二氢杨梅素和少量的二氢槲皮素组成[26]。因此，VTE能显著抑制素肉丸在冷藏期间发生的脂质氧化是合理的。

图 2 VTE对素肉丸在冷藏期间TBARS值的影响Fig. 2 Effect of VTE on TBARS value of vegetarian meatballs during refrigerated storage

2.2.3 羰基含量的变化

图 3 VTE对素肉丸在冷藏期间羰基含量的影响Fig. 3 Effect of VTE on carbonyl content of vegetarian meatballs during refrigerated storage

除了脂质氧化之外，蛋白质氧化是食品劣化的另一个主要原因，可通过测定所形成的羰基的量来评估蛋白质氧化的程度[27-28]。如图3所示，在冷藏期间，所有组素肉丸的羰基含量均显著增加（P＜0.05）。空白对照组、0.01% BHT、0.1% VTE和0.3% VTE组的初始羰基含量分别为1.76、1.62、1.58 nmol/mg和1.51 nmol/mg。因此，在冷藏刚开始时，0.3% VTE就可以显著抑制蛋白质的初始氧化（P＜0.05）。经VTE处理的素肉丸在整个冷藏期间的羰基含量均显著低于空白对照组（P＜0.05），说明VTE可以显著抑制素肉丸贮藏过程中羰基化合物的形成，其抑制作用甚至高于0.01% BHT。冷藏结束时，空白对照组、0.01% BHT、0.1% VTE和0.3% VTE组的羰基含量分别为3.39、2.91、2.75 nmol/mg和2.42 nmol/mg，与先前的报道证明天然抗氧化剂，如水果提取物中的酚类化合物可以显著抑制羰基化合物的形成[29]结果类似。

2.2.4 巯基含量的变化

图 4 VTE对素肉丸在冷藏期间巯基含量的影响Fig. 4 Effect of VTE on sulfhydryl content of vegetarian meatballs during refrigerated storage

蛋白质氧化还与巯基的丧失有关，半胱氨酸硫醇基团的氧化可以促进分子间二硫键的形成，导致巯基含量减少[6]。因此，巯基含量是广泛用于衡量蛋白质氧化程度的重要指标之一。如图4所示，在冷藏期间，所有组素肉丸的巯基含量均显著下降（P＜0.05）。经VTE处理的素肉丸在整个冷藏期间的巯基含量均显著低于空白对照组（P＜0.05），说明VTE的加入加速了巯基的损失，与Xu Liang等[30]的研究结果一致。此外，本课题组前期研究也发现了类似的现象，即在混合猪肉饼中加入VTE也会加速巯基的损失[26]。可能是由于蛋白质巯基与酚类化合物之间发生了相互作用，邻位酚结构容易与亲核巯基形成共价键，形成巯基-肟加合物，导致巯基损失。

3 讨 论

VTE可以有效抑制素肉丸在冷藏期间发生的脂质氧化和蛋白质氧化，这可能是由于VTE中含有丰富的二氢杨梅素。本实验以二氢杨梅素为标准品，测定发现VTE含有较高的黄酮质量分数，为8.14%。二氢杨梅素可以显著抑制肉制品在冷藏期间的脂质氧化和蛋白质氧化，质量分数0.02%二氢杨梅素抑制作用比质量分数0.02%丁基羟基茴香醚更强[20]。黄酮类化合物作为一种抗氧化植物酚类，它们的抗脂质氧化机制主要归因于它们具有清除自由基或螯合金属的能力[31]。酚通过向自由基提供氢原子，自身被氧化成苯氧基，苯氧基是一种相当稳定的自由基，可以抑制自由基介导的脂质和蛋白质的氧化，从而防止脂质或蛋白质的进一步氧化[32]。但VTE与仿肉产品氧化的确切作用机制尚不清楚，需要进一步探索。

二氢杨梅素是VTE的主要成分，本实验证明了VTE可有效抑制素肉丸在冷藏期间TBARS值的增加和羰基化合物的形成。虽然本实验没有比较VTE和二氢杨梅素对素肉丸贮藏过程中品质影响的差别，但先前的研究表明二氢杨梅素在防止豆油氧化方面比VTE更有效，但VTE和二氢杨梅素在降低煮熟的牛肉TBARS值方面没有显著差异[20]。在该实验中，没有研究VTE和二氢杨梅素保存素肉丸的原因是因为二氢杨梅素的提取过程更复杂且成本更高。因此，与二氢杨梅素相比，VTE对混合猪肉饼的抗氧化作用的研究具有较高的实际意义。

与空白对照组相比，0.1%、0.3% VTE可以更好地保持素肉丸贮藏过程中水分质量分数、L*值及弹性（P＜0.05）；显著抑制素肉丸POV和TBARS值的增加，当冷藏8 d时，其抑制作用与0.01% BHT没有显著性差异（P＞0.05）；显著抑制素肉丸中羰基化合物的形成（P＜0.05），其抑制效果好于0.01% BHT，并呈良好的剂量效应关系。因此，VTE对于素肉丸保藏具有实际意义，可抑制其变质，从而延长保质期。