茉莉酸甲酯结合低温预贮对尖椒采后品质及生理特性的影响

刘 瑶，郑秋丽，左进华，高丽朴，刘 婧,2，史君彦，李 淼*，王 清,*

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部蔬菜产后处理重点实验室，果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，农业农村部都市农业（北方）重点实验室，北京 100097；2.安徽农业大学植物保护学院，安徽 合肥 230000）

尖椒（Capsicum frutescensL.）又名辣椒，茄科植物。在我国广泛种植栽培[1]，不仅感官良好、气味芬芳[2]，且含有丰富的VC、叶酸、镁及钾等营养成分[3]，还具有温中散寒、开胃消食的功效。但由于尖椒果肉脆嫩，采后代谢极旺盛，所以较易出现失水萎蔫、果皮转红、根蒂衰老等现象[4]。因此，研究采后如何妥当贮藏、延长尖椒在贮藏期间的品质具有重要意义。

低温贮藏广泛运用在果蔬保鲜中，如水蜜桃、黄瓜、芥兰、白芹、刺嫩芽、小青菜等[5-7]，但尖椒对低温敏感，在低温条件下贮藏极易发生冷害[8]，影响其货架品质和营养品质，如何调节贮藏期间温度、保持尖椒在贮藏期间品质尤为重要。低温预贮（low temperature conditioning，LTC）是将果蔬等产品放在略高于冷害临界温度下预贮一段时间，从而减轻后续冷藏期间冷害发生的一种温度调控方法[9]。其特点是对果蔬无污染、无化学伤害[10]、操作简便、可对果蔬进行批量处理，因此现今，LTC技术被国内外研究者重视。目前的研究表明，经过LTC技术处理后的猕猴桃、葡萄、石榴、枇杷、茄子等果蔬[11-12]，其冷害发生率降低，商品性升高。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物天然产生的生长调节物质，广泛存在于植物界中，其特点是在植物的正常生长发育和逆境反应中都起着重要作用[13]。桂连友等[14]将MeJA对植物的诱导效应归结为以下4 种，分别是：直接防御、间接防御、不防御和负防御。王光[15]使用MeJA浸泡菜心，有效提高了菜心的商品价值和营养品质；刘波等[16]用MeJA处理采后茄子，保持了其贮藏品质；李天等[17]用MeJA处理鲜切芹菜，有效保持了其生理品质。研究表明，MeJA浸泡可延长蔬菜贮藏时间，有效延缓在贮藏期间营养物质损失，延长其货架期。

虽然现阶段已有LTC和MeJA单独处理采后果蔬的研究和应用，且均表现出较好的贮藏效果，但LTC和MeJA复合处理蔬菜却鲜有研究，尖椒低温贮藏和LTC单独处理虽然可以延长贮藏时间、延缓腐烂，但前者却会使尖椒发生冷害现象，后者会降低营养物质含量，使其失去商品价值，因此生产上需要多个处理同时应用，以提高蔬菜的贮藏品质。研究MeJA和LTC复合处理在尖椒的贮藏保鲜方面具有实际意义。

本实验以‘金英达’尖椒为试材，探究4 ℃冷库贮藏、LTC单独处理和MeJA结合LTC处理对采后尖椒果实贮藏期间品质及生理特性的变化。通过比较3 种处理下尖椒各项指标，研究复合处理对尖椒采后贮藏的可行性，为尖椒的采后贮藏保鲜技术提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验尖椒品种为‘金英达’，在天安公司小汤山基地采收，采收当天运回实验室，并挑选无机械伤、无病虫害、成熟度一致的尖椒为实验材料。

保鲜膜：0.04 mm聚乙烯（polyethylene，PE）膜，购于北京华盾雪花有限公司。

草酸、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、抗坏血酸，乙二胺四乙酸二钠、钼酸铵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸 西陇化工有限公司；偏磷酸、愈创木酚 国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、过氧化氢北京化工厂；TRIzol试剂 美国Invitrogen公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800分光光度计 日本岛津公司；D-37520冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；XMTD-6000型数显恒温水浴锅 余姚金电仪表有限公司；DYY-6D型电泳仪 北京市六一仪器厂；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 德国耶分析仪器股份有限公司；GelDoxXR凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；LightCycler480II实时荧光定量PCR系统瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理与分组

将挑选好的尖椒随机分为3 组，分别为A、B、C组。预实验发现，5 μmol/L MeJA结合LTC处理尖椒的效果最佳，根据此条件，进行如下处理：A组尖椒在常温下，置于清水中浸泡10 min，晾干后装入厚度4 mm PE保鲜袋中，折口包装，于4 ℃贮藏35 d，作为CK组。B组尖椒在常温下清水中浸泡10 min，晾干后折口装入PE保鲜袋中，放置10 ℃贮藏2 d后，再转入4 ℃冷库中贮藏33 d，作为LTC处理组。C组尖椒在常温下，置于5 μmol/L MeJA溶液中浸泡10 min，晾干后折口包装于PE保鲜袋中，10 ℃贮藏2 d后，转入4 ℃库中贮藏33 d，作为MeJA结合LTC复合处理组。每7 d（包括第2天）对A、B组和C组尖椒进行观察、取样和相关指标的测定。取样时，取尖椒果实的果肉，将果肉迅速切成小块放入液氮中冷冻，再将冷冻后的样品置于-80 ℃冰箱中冷冻保存，用于生理指标的测定。每个处理随机取10 个果实，每个处理3 次重复。

1.3.2 冷害指数的测定

尖椒的冷害级数以发生冷害的面积进行评定，具体标准参考表1[18]，尖椒的冷害表现为果面开始出现凹陷斑块，凹陷部分表皮随着贮藏时间的延长褪绿、腐烂，呈不规则排列。测定时，取尖椒果实，选10 人建立评分小组进行肉眼观察，冷害指数按照下式进行计算。

表 1 尖椒冷害级数评定Table 1 Evaluation criterion for chilling injury level of hot pepper

1.3.3 叶绿素含量的测定

叶绿素含量测定采用Deng Yongsheng等[19]的方法，并稍作修改。取尖椒果实组织0.5 g，加入丙酮与乙醇（体积比为2∶1）混合溶液匀浆，于4 ℃、13 000hg离心10 min，取上层清液分别在645 nm和663 nm波长处测定吸光度。

1.3.4 VC含量的测定

VC含量的测定采用钼酸铵比色法[20]。取尖椒组织1 g，加入5 mL 0.05mol/L草酸-0.2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液，匀浆，于4 ℃、13 000hg离心20 min，收集2 mL上层清液备用。向收集的2 mL上清液中加入3 mL 0.05 mol/L草酸-0.2 mmol/L EDTA、0.5 mL偏磷酸乙酸溶液（30 g偏磷酸中加入40 mL水，加热搅拌溶解后过滤，再加入8 mL乙酸、52 mL水）、1 mL体积分数5%硫酸、2 mL 50 g/L钼酸铵溶液，将混合液摇匀后于80 ℃保温10 min，冷却后定容至10 mL，测定其在760 nm波长处的吸光度。

1.3.5 丙二醛含量的测定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法[21]。取尖椒果实组织1 g，用5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液提取，于4 ℃、13 000hg离心20 min，取2 mL上层清液加入2 mL 6.7 g/L的硫代巴比妥酸溶液煮沸20 min，测定其在450、532 nm和600 nm波长处的吸光度。

1.3.6 相关抗氧化酶活力的测定

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力测定采用愈创木酚法[22]，称取1 g尖椒组织，用pH 7.8的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）提取，于4 ℃13 000hg离心30 min，取0.1 mL上层清液备用。将1 mL 0.1 mol/L pH 7.8 PBS、0.9 mL 2 mL/L愈创木酚、1 mL体积分数0.3% H2O2溶液和0.1 mL上述上层清液混匀作为反应体系，测定反应体系在470 nm波长处的吸光度。

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力测定采用Platt-Aloia等[23]的方法进行测定。称取1 g尖椒组织，与pH 7.8 PBS在4 ℃ 13 000hg离心30 min，取上层清液。反应体系包括1.9 mL 0.1 mol/L pH 7.8 PBS、1 mL体积分数0.3% H2O2和0.1 mL上述清液，测定在240 nm波长处的吸光度。

抗坏血酸过氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）活力测定采用Wang Qing等[24]的方法。取1 g尖椒组织，加入5 mL pH 7.5 PBS，在4 ℃ 13 000hg离心20 min，取上清液，作为酶提取液。将2.6 mL pH 7.5 PBS、0.3 mL体积分数0.3% H2O2和0.1 mL酶提取液作为反应体系，测定反应体系在290 nm波长处的吸光度。

1.3.7 相关抗氧化酶基因表达的测定

采用实时荧光定量PCR法分析抗氧化酶基因表达，采用TRIzol试剂提取总RNA，操作方法为：取0.1 g尖椒组织加入1 mL TRIzol混匀后，于4 ℃ 12 000hg离心10 min，按说明书要求分别加入0.2 mL氯仿、0.5 mL异丙醇、1 mL体积分数75%乙醇溶液，提取尖椒总RNA。取样本RNA进行反转录，合成第一链cDNA。根据美国国立生物技术信息中心公布的青椒基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，以UBI-3作为内参基因，POD、CAT、APX为目的基因，由上海生物工程有限公司完成引物的合成，引物的设计序列如表2所示。合成的cDNA与目的基因在96 孔板点样，进行定量PCR，并于LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，每个样品做3 个重复，反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40 次循环。将实时荧光定量PCR数据用2-ΔΔCt法分析，利用LightCycler 480II实时荧光定量PCR系统软件进行相对定量的数据分析[25]。

1.4 数据统计与分析

数据整理采用Excel 2010软件，利用Origin 9.0软件作图，利用SPSS 22软件对数据进行单因素方差分析和t检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 MeJA结合LTC联合处理对尖椒冷害指数的影响

图 1 MeJA结合LTC联合处理对尖椒冷害指数的影响Fig. 1 Effect of MeJA + LTC treatment on chilling injury index of hot pepper fruit

尖椒在低温条件下贮藏极易发生冷害现象，冷害现象为果蔬在贮藏过程中发生的生理伤害[26]，具体表现为尖椒果实表皮出现水渍状凹陷，表皮颜色发暗，失去光泽[27]。如图1所示，尖椒在低温贮藏期间出现了冷害现象，CK组尖椒在贮藏第7天出现冷害，LTC处理组尖椒在贮藏第21天发生明显冷害，而MeJA+LTC处理组在贮藏第28天出现冷害，比CK组和LTC处理组出现冷害时间分别延缓了21 d和7 d。在贮藏末期，CK组和LTC处理组尖椒的冷害指数达到77%和51%，而MeJA+LTC处理组尖椒的冷害指数仅为30%，显著低于CK组和LTC处理组（P＜0.05）。综上可说明，MeJA+LTC处理可以明显延缓尖椒在贮藏期间出现冷害的时间，抑制冷害发生进程。

2.2 MeJA结合LTC联合处理对尖椒叶绿素含量的影响

尖椒颜色是影响消费者购买的第一指标[28]，随着贮藏时间的延长，尖椒由绿转红[29]，此时尖椒衰老，商品性下降。由图2所示，在贮藏期间，尖椒的叶绿素含量呈下降趋势，即在贮藏期间，尖椒逐渐褪绿。CK组尖椒贮藏前期叶绿素含量迅速下降，于第21天降至最低值（0.028 mg/g），21 d后CK组尖椒叶绿素含量保持平缓，贮藏末期叶绿素含量为0.029 mg/g。LTC处理组和MeJA+LTC处理组尖椒在贮藏7 d后，叶绿素含量始终高于CK组，在贮藏第35天，LTC处理组和MeJA+LTC处理组叶绿素含量均达到最低值，分别为0.029 mg/g和0.033 mg/g，且MeJA+LTC处理组叶绿素含量显著高于CK组和LTC处理组（P＜0.05）。实验表明，MeJA+LTC处理可延缓尖椒在贮藏期间叶绿素含量的降低，保持尖椒的色泽品质，延长贮藏时间。

图 2 MeJA结合LTC联合处理对尖椒叶绿素含量的影响Fig. 2 Effect of MeJA + LTC treatment on chlorophyll content of hot pepper fruit

2.3 MeJA结合LTC联合处理对尖椒VC含量的影响

图 3 MeJA结合LTC联合处理对尖椒VC含量的影响Fig. 3 Effect of MeJA + LTC treatment on vitamin C content of hot pepper fruit

尖椒果实组织中富含VC，其含量可以在一定程度上决定尖椒的贮藏品质，而且VC也可作为尖椒组织内延缓衰老的一种抗氧化剂[2]，因此VC含量可作为尖椒抗衰老的重要指标之一[30]。如图3所示，随着贮藏时间的延长，各组尖椒的VC含量均呈现下降趋势，在贮藏前14 d，CK组和LTC处理的尖椒VC含量迅速下降，分别降低了27.4%和19.7%，而MeJA+LTC处理组的尖椒下降较为缓慢，仅降低了4.3%。在贮藏后期，LYC和MeJA+LTC组的VC含量下降较为缓慢，可能是由于尖椒在低温贮藏期间进行呼吸作用，减少了自由基的形成，延缓了衰老，从而延缓了尖椒组织内VC含量的下降[31]。在贮藏末期，MeJA+LTC处理的尖椒VC含量显著高于CK组和LTC处理组（P＜0.05）。因此，MeJA+LTC处理尖椒可延缓其贮藏期间VC含量的降低。

2.4 MeJA结合LTC联合处理对尖椒MDA含量的影响

图 4 MeJA结合LTC联合处理对尖椒MDA含量的影响Fig. 4 Effect of MeJA + LTC treatment on MDA content of hot pepper fruit

MDA是植物细胞膜脂过氧化的重要产物之一，其含量的高低可用来评价尖椒组织细胞膜的受损程度和脂质过氧化程度[32]，由图4所示，在贮藏期间，CK组、LTC处理组和MeJA+LTC处理组的尖椒MDA不断积累，贮藏第35天，各组尖椒的MDA含量达到最高，CK组和LTC处理组MDA含量分别比MeJA+LTC处理组显著高32.9%和15.4%（P＜0.05）。说明MeJA+LTC处理可以明显抑制尖椒在贮藏期间MDA的积累，降低尖椒组织细胞的损伤，延缓采后衰老。

2.5 MeJA结合LTC联合处理对尖椒POD活力和POD基因表达量的影响

图 5 MeJA结合LTC联合处理对尖椒POD活力（A）和POD基因表达量（B）的影响Fig. 5 Effect of MeJA + LTC treatment on POD activity (A) and gene expression (B) in hot pepper

POD作为尖椒组织中的保护酶，其可在果实遭受逆境胁迫时调节尖椒果实的代谢，保护其正常的生理活动[33]，同时POD在植物在植物组织中可通过参与反应减轻活性氧自由基对尖椒细胞的损伤[34]。由图5A可知，在贮藏前期，各组POD活力快速下降，在贮藏前2 d，CK组、LTC处理组和MeJA+LTC处理组的POD活力分别下降了24%、20%和13%。在贮藏第28天，各组POD活力达到极高值，MeJA+LTC处理组的POD活力显著高于其他两组（P＜0.05），之后各组POD活力下降，降至贮藏期间的最低值。由图5B可知，POD基因表达量在尖椒贮藏期间的变化趋势与POD活力相似，在贮藏第2天，CK组和两个处理组尖椒的POD基因表达量均较低，之后逐渐升高，并于贮藏第21天升高至极高值，此时MeJA+LTC处理组与CK组和LTC处理组呈现显著差异（P＜0.05）。贮藏21 d后，尖椒的POD基因表达量迅速下降。结果表明，MeJA+LTC处理可有效延缓POD活力的下降和POD基因表达量的降低，降低尖椒组织细胞的损伤，保持其贮藏品质。

2.6 MeJA结合LTC联合处理对尖椒CAT活力和CAT基因表达量的影响

图 6 MeJA结合LTC联合处理对尖椒CAT活力（A）和CAT基因表达量（B）的影响Fig. 6 Effect of MeJA＋LTC treatment on CAT activity (A) and gene expression (B) in hot pepper

CAT在尖椒组织细胞中广泛存在，其主要作用是把活性氧转变为低活性物质，从而保护尖椒细胞膜系统[35]，避免植物组织细胞受到逆境伤害。由图6A可知，尖椒在贮藏期间CAT活力呈现先上升后下降的趋势，在贮藏前期，CAT活力缓慢上升，并于第7天达到峰值。这可能是由于尖椒在贮藏初期受到了逆境伤害，呼吸作用产生的大量H2O2促进了组织中CAT活力的增强，避免尖椒组织果实受到H2O2的毒害[36]。贮藏7 d后，CK组和两处理组的CAT活力持续下降，第35天时3 组尖椒的CAT活力降至最低值，CK组和LTC处理组较贮藏0 d时分别降低了53.7%和52.9%，而MeJA+LTC处理组的CAT活力降低了34.5%，且与CK组和LTC处理组差异显著（P＜0.05）。由图6B可知，在贮藏期间，尖椒的CAT基因表达量与CAT活力变化趋势相似，于第2天达到峰值。结果表明，MeJA+LTC处理可以有效延缓采后尖椒CAT活力的降低，延缓尖椒组织的衰老，保持其贮藏品质。

2.7 MeJA结合LTC联合处理对尖椒APX活力和APX基因表达量的影响

图 7 MeJA结合LTC联合处理对尖椒APX活力（A）和APX基因表达量（B）的影响Fig. 7 Effect of MeJA + LTC treatment on APX activity (A) and gene expression (B) in hot pepper

尖椒组织中的APX是植物组织中防御外界氧化胁迫和其自身活性氧代谢的重要抗氧化酶类[27]，其催化抗坏血酸与H2O2发生氧化还原反应，使其氧化成单脱氢抗坏血酸，同时促使H2O2被分解[37]，降低H2O2对尖椒细胞产生的氧化损伤。由图7可知，尖椒在贮藏过程中，APX活力呈下降趋势，且在贮藏14 d后，MeJA+LTC处理组的APX活力始终高于CK组和LTC处理组，在贮藏14～21 d，MeJA+LTC处理组的尖椒APX活力有小幅度上升，之后快速下降。贮藏末期，3 组尖椒的APX活力降至最低值，CK组降至贮藏初始值的35.4%，LTC处理组和MeJA+LTC处理组分别降至初始值的58.8%和70.3%，呈现显著差异（P＜0.05）。如图7B所示，贮藏期间，CK组和LTC处理组的APX基因表达量呈逐渐下降趋势，在贮藏末期达到最低水平，而MeJA+LTC处理组的APX基因表达量在贮藏2～21 d有小幅度上升，21 d后下降，在贮藏末期也达到最低值。APX基因表达量在贮藏期间与其活力呈现相似趋势，实验结果表明，MeJA+LTC处理可以有效延缓尖椒贮藏期间APX活力的降低，维持尖椒细胞组织的完整性，保持其贮藏品质。

3 讨 论

尖椒在低温下极易发生冷害现象，发生冷害的尖椒其感官品质和营养品质均会发生下降[7]，采用LTC结合MeJA对采后尖椒进行复合处理，可以有效缓解尖椒冷害现象的发生，保持尖椒贮藏期间的感官品质和商品价值。本实验将采后的尖椒浸泡于5 μmol/L MeJA溶液中，贮藏期间先置于10 ℃贮藏2 d，再置入4 ℃冷库中贮藏，贮藏期间，对尖椒的叶绿素含量、VC含量、MDA含量和抗氧化酶活力进行测定。实验表明，单独LTC处理的尖椒，贮藏期间其品质和营养成分要优于CK组，这与之前的研究报道结果[4-9]相同。在贮藏期间，MeJA+LTC处理可以有效延缓尖椒叶绿素和VC含量的快速降低，贮藏末期，联合处理组的叶绿素和VC含量明显高于CK组，有效延缓了尖椒果实营养物质的流失。同时，MeJA+LTC联合处理可以有效抑制尖椒组织中MDA的积累，在贮藏末期，CK组和LTC处理组尖椒MDA含量比MeJA+LTC联合处理组分别高32.9%和15.4%，说明MeJA+LTC联合处理能有效延缓尖椒果实在贮藏期间的衰老，保持细胞的完整性，与文献[32]的结论一致。与CK组和LTC处理组相比，MeJA+LTC联合处理组尖椒的POD、CAT、APX活力保持较高水平，其基因相对表达量与酶活力变化趋势相似，说明MeJA+LTC处理可以抑制活性氧自由基的产生，与文献[34]的结论一致，降低细胞过氧化的损伤，有效维持尖椒在贮藏期间的生理品质和营养品质。因此，MeJA+LTC联合处理采后尖椒可提高尖椒的贮藏品质，运用此种方法处理尖椒具有高效、安全和便捷等特点，不仅仅可以用于尖椒果实的保鲜贮藏，还可推广至其他蔬果的采后贮藏技术中。