涡流空化改善大豆分离蛋白溶解性的分子间作用机制

任仙娥，李春枝，杨 锋，黄永春，阎柳娟

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西糖资源绿色加工重点实验室，广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006）

大豆蛋白氨基酸组成合理，含有能降低胆固醇、预防心血管疾病的生理活性成分，并具有良好的加工性能以及较低的成本，常作为重要的食品配料广泛应用于食品行业[1]。大豆分离蛋白是一种重要的商用大豆蛋白产品，主要成分为大豆球蛋白和β-伴球蛋白，这些蛋白组分在生产加工过程中受到酸沉、高温的影响，极易发生变性，变性后的蛋白质进一步聚集形成大的聚集体甚至沉淀，导致商用大豆分离蛋白的溶解性较差[2]。蛋白质的大部分功能性质都与溶解性有关，低溶解性使得很多功能性质也变差。商用大豆分离蛋白的低溶解性极大地限制了它在食品工业中的应用[3]。因此，很多物理、化学和生物学方法都被用来改性大豆蛋白以提高其溶解性，进而改善其功能性质[4-6]。

空化技术是一项食品物理加工新技术。在空化过程中，空化泡溃灭的瞬间会产生局部极端瞬时高温、高压，并伴有强烈的冲击波、微射流、湍流、高剪切力，同时还产生自由基等效应，这些效应能诱导或加速一些物理化学反应的发生[7-8]。目前常用的空化方式有超声空化和水力空化[9]。Ashokkumar[10]、O’Sullivan[11]和白复笑[12]等研究表明，超声空化能破坏蛋白质分子之间的相互作用，使蛋白质的构象发生变化、大的聚集体解聚、分子结构部分展开、表面疏水性增加，进而使部分功能性质得到改善。本课题组前期研究结果表明，基于涡流的水力空化能使大豆分离蛋白粒径减小，表面疏水性增加，二级结构发生变化，溶解性可由处理前的（45.23f2.48）%增加至（89.24f1.81）%，与此同时，其乳化性和起泡性等功能性质也得到很大改善[13-14]。蛋白质的溶解性和功能性质与其构象密切相关，而蛋白质的构象是通过离子键、氢键、二硫键、疏水相互作用等分子间作用力来维持的[15]。本实验进一步研究涡流空化引起的大豆分离蛋白分子间作用力的变化，并分析它与溶解性改善之间的关联，来探讨涡流空化改善大豆分离蛋白溶解性的作用机制，为水力空化技术在蛋白质改性领域的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（蛋白质量分数≥90%）购于山东禹王生态食品有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；BSA224S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直电泳系统 美国伯乐公司。

涡流空化实验装置由实验室自制，其结构示意图见图1，由储液罐、压力表、涡流泵、阀门和管道组成。流体从储液罐流经涡流泵，再回到储液罐。涡流泵中电机驱动叶轮旋转，当流体流经旋转的叶轮时，产生漩涡，导致中心压力降低，当压力低于液体的蒸汽压时，空化泡产生，随着叶轮的旋转，空化泡又被甩出，当压力增大时，空化泡破灭，产生空化效应。

图 1 涡流空化装置图Fig. 1 Schematic diagram of swirling cavitation

1.3 方法

1.3.1 涡流空化处理大豆分离蛋白

用去离子水将大豆分离蛋白粉末配成3 g/100 mL的分散液，待其充分溶解后，倒入储液罐中，开启冷却水，开启涡流泵，调节压力，分别在0.2、0.4、0.6 MPa下处理不同时间（5、10、30、60 min）。经处理后的样品冻干后备用。

1.3.2 还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）参照Jiang Lianzhou等[16]的方法，配制质量分数13%的分离胶、4%的浓缩胶。将蛋白质样品稀释至3 mg/mL，取40 μL稀释后的蛋白液与80 μL样品缓冲液（3.55 mL去离子水、1.25 mL 0.5 mol/L pH 6.8的Tris-HCl、2.5 mL甘油、2.0 mL 10 g/100 mL SDS和0.2 mL 0.5 g/100 mL溴酚蓝混合均匀后于室温下贮存，使用时取出950 μL与50 μLβ-巯基乙醇混合），混合均匀后于95 ℃下加热5 min，冷却后上样，上样量为10 μL。电泳时蛋白质样品在浓缩胶中电流为16 mA，进入分离胶后将电流调为28 mA。电泳结束后，先对其进行固定，然后采用考马斯亮蓝R250染色，再进行脱色，直至出现清晰的蛋白条带为止，最后使用凝胶成像系统进行成像处理。

1.3.3 分子间作用力的测定

参照Tan[17]和刘书成[18]等的方法，略作修改，具体操作步骤如下：取0.6 g样品加入20 mL S1（0.6 mol/L NaCl），充分搅拌溶解后于10 000 r/min离心10 min后取出上清液。再向所得沉淀中加入20 mL S2（1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液），充分搅拌溶解后于10 000 r/min离心10 min后取出上清液。再向所得沉淀中加入20 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液），充分搅拌溶解后于10 000 r/min离心10 min后取出上清液。再向上述所得沉淀中加入20 mL S4（0.5 mol/Lβ-巯基乙醇、8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液，pH 7）充分搅拌溶解后于10 000 r/min离心10 min后取出上清液。向上述每一步离心所得上清液中分别加入等体积的20 g/100 mL三氯乙酸，于10 000 r/min离心10 min，弃上清液，向所得沉淀中（包括未溶于S4的沉淀）分别加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液，利用Lowry法测定其蛋白质含量[19]。以溶解于S1的蛋白质含量占总蛋白质含量的比例来表示离子键含量，以溶解于S2的蛋白质含量占总蛋白质含量的比例来表示氢键含量，以溶解于S3的蛋白质含量占总蛋白含量的比例来表示疏水相互作用的强弱，以溶解于S4的蛋白质含量占总蛋白质含量的比例来表示二硫键含量，以经S4提取后最终所得沉淀的蛋白质含量占总蛋白质含量的比例来表示非二硫共价键含量。

1.4 数据统计与处理

每个实验均重复3 次，结果表示为平均值±标准差，利用SPSS 21软件对数据进行统计分析，采用Duncan法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，相关性分析采用Pearson分析。

2 结果与分析

2.1 涡流空化对大豆分离蛋白分子质量分布的影响

大豆蛋白的主要成分为大豆球蛋白和β-伴球蛋白。大豆球蛋白由一个酸性多肽和一个碱性多肽通过二硫键连接，β-伴球蛋白由α、α’和β3 个亚基组成[1]。为了判断大豆分离蛋白经涡流空化处理后其溶解性的改善是否由蛋白质的水解引起，取出经涡流空化处理时间较长（30 min和60 min）的样品，通过还原SDS-PAGE来说明涡流空化是否引起大豆分离蛋白肽键的断裂导致其分子质量发生变化。

图 2 涡流空化对大豆分离蛋白分子质量分布的影响Fig. 2 Effect of swirling cavitation on molecular mass distribution of SPI

由图2可以看出，不同压力下涡流空化处理30 min和60 min后均未引起大豆蛋白各条带的变化，无小分子质量条带的产生，说明涡流空化处理并未使大豆分离蛋白的肽键断裂，所以溶解性的改善不是由蛋白质的水解引起的。Hu Hao等[20]在研究超声波对大豆分离蛋白理化性质的影响时也发现不同功率的超声波处理能改善大豆分离蛋白的溶解性，但是并不引起肽键的断裂，因此其认为超声波处理后大豆分离蛋白溶解性的改善不是由蛋白质的水解引起的，而是由构象的变化引起的。O’Sullivan等[21]也报道过相似的结论。

2.2 涡流空化对大豆分离蛋白分子间作用力的影响

2.2.1 涡流空化对大豆分离蛋白离子键含量的影响

图 3 涡流空化对大豆分离蛋白离子键含量的影响Fig. 3 Effect of swirling cavitation on the content of ionic bonds in SPI

由图3可知，大豆分离蛋白在未处理时离子键含量为（18.34f0.95）%，经涡流空化处理后离子键含量显著增加（P＜0.05）。随着处理时间的延长离子键含量不断增加，在不同压力下处理60 min后，离子键含量分别达到（44.93f1.66）%（0.2 MPa）、（56.04f2.75）%（0.4 MPa）和（68.02f4.26）%（0.6 MPa）。前期研究结果表明，经涡流空化处理后，大豆分离蛋白高级结构被破坏，一些大的聚集体解聚，平均粒径降低，分子结构部分展开，更多的带电氨基酸残基暴露于分子表面[13]，这有利于离子键的形成。Jambrak等[22]研究发现，超声空化能改变乳清蛋白的高级结构，也使带电氨基酸残基数量增加，溶解性增加。

由图3还可以看出，处理相同时间时，压力越大离子键含量增加越明显，这与空化现象的形成有关。更高的压力使流体流经涡流泵的速率更高，导致漩涡中心的压力下降得更多，从而形成更多的空化泡，空化强度也更大[23]，蛋白质样品的解聚程度更大，从而暴露出更多的氨基酸残基，有利于离子键的形成。

2.2.2 涡流空化对大豆分离蛋白氢键含量的影响

图 4 涡流空化对大豆分离蛋白氢键含量的影响Fig. 4 Effect of swirling cavitation on the content of hydrogen bonds in SPI

氢键是一种弱键，在维系和促进蛋白质构象形成，特别是在二级结构的形成中起着极其重要的作用[24]。由图4可知，涡流空化处理对大豆分离蛋白氢键含量的影响与其处理压力和时间有关。在空化压力为0.2 MPa时，处理5 min后，氢键含量有所增加，但随着处理时间继续延长，氢键含量开始降低；在空化压力为0.4 MPa时，氢键含量随着处理时间的延长逐渐增加，但是处理时间超过30 min后，氢键含量显著降低（P＜0.05）；在空化压力为0.6 MPa时，氢键含量随着处理时间的延长显著降低（P＜0.05），处理60 min后氢键含量可由0 min时的（6.87f0.77）%减小到（2.88f0.39）%。刘书成等[18]研究表明，氢键对温度比较敏感，温度越高，氢键越弱，50 ℃的热效应已经能对氢键产生强烈的破坏作用。涡流空化过程中产生局部瞬时高温等空化效应，会破坏氢键，导致氢键含量下降。同时，氢键断裂使大豆分离蛋白发生解聚，高级结构被破坏，分子展开，更多的侧链基团暴露出来，又可形成新的氢键。由此推测，涡流空化处理过程中氢键的断裂和形成同时发生，而不同压力产生的空化效应有所差别，导致氢键形成和断裂的速率不同，所以涡流空化在不同压力和处理时间下对氢键的影响不同。另外，前期的研究结果表明，涡流空化处理使大豆分离蛋白的二级结构发生变化，其中β-折叠含量增加，α-螺旋、β-转角和无规卷曲含量均降低，但是增加和降低的幅度随处理压力和时间的不同而不同[13]。α-螺旋含量的降低意味着蛋白分子内部相邻肽链之间的氢键受到破坏，而β-折叠含量的增加则说明又有新的氢键形成，这也说明了涡流空化处理过程中氢键的断裂和形成同时发生。张文等[25]在研究超声波对花生蛋白分子结构的影响时，发现超声波的空化作用能破坏蛋白质分子内氢键，使其二级结构发生变化。齐宝坤等[26]发现热处理能使大豆球蛋白分子中的氢键发生变化，导致其二级结构发生变化，进而影响其溶解性。

2.2.3 涡流空化对大豆分离蛋白疏水相互作用的影响

图 5 涡流空化对大豆分离蛋白疏水相互作用的影响Fig. 5 Effect of swirling cavitation on the content of hydrophobic interaction in SPI

疏水相互作用是疏水基团为了避开水分子而被迫靠近的现象，它在维持蛋白质三级结构的稳定和四级结构的形成中占有突出的地位[24]。由图5可知，在空化压力为0.2 MPa和0.4 MPa时，处理初期疏水相互作用增加，这是因为空化处理使蛋白质的结构展开，大的聚集体解聚，包埋在分子内部的疏水性氨基酸残基暴露出来，有利于疏水相互作用的增加；但是随着处理时间的继续延长，疏水相互作用下降。而在0.6 MPa时，疏水相互作用则随着处理时间的延长均显著降低（P＜0.05）。在处理60 min后，所有经过涡流空化处理后大豆分离蛋白的疏水相互作用均显著低于未处理的（P＜0.05），可由未处理时的（34.55f1.86）%分别减小到（20.26f1.52）%（0.2 MPa）、（14.75f1.61）%（0.4 MPa）和（7.46f1.44）%（0.6 MPa）。这说明随着处理时间的延长和压力的增大，空化效应对疏水相互作用的破坏更强，所以虽然疏水基团暴露出来，但疏水相互作用还是降低的。Hu Hao等[20]在研究超声波对大豆分离蛋白理化性质的影响时也发现，超声空化产生的湍流、高压和高剪切等空化效应也能破坏蛋白分子间的疏水相互作用，并且随着超声空化强度的增加和处理时间的延长，疏水相互作用的破坏增加，溶解性显著增加。

2.2.4 涡流空化对大豆分离蛋白二硫键含量的影响

二硫键是蛋白质多肽链内或不同链间的两个半胱氨酸残基的巯基氧化形成的，它对蛋白高级结构的形成与稳定起着重要作用[24]。由图6可知，未处理的大豆分离蛋白二硫键含量为（24.16f1.14）%。与未处理的蛋白相比，涡流空化处理能显著降低二硫键含量（P＜0.05），且随处理压力和时间的延长而降低，降低幅度随着空化压力的变化而不同，其中在0.6 MPa下二硫键含量降低最多。大豆分离蛋白溶液经0.2、0.4 MPa和0.6 MPa处理60 min后二硫键含量分别为（12.57f1.13）%、（10.42f0.90）%和（10.34f2.21）%。二硫键含量降低的原因是涡流空化时产生的局部极端高温、高压、高剪切力和湍流等作用能使二硫键断裂。文鹏程等[27]在研究不同处理条件对乳铁蛋白构象的影响时发现，超声空化处理能使乳铁蛋白的二硫键含量降低33.7%；Hu Hao等[28]也发现超声空化处理能使大豆分离蛋白的二硫键断裂转化为巯基，导致其平均粒径也减小，溶解性增加；毕爽[29]和Petruccelli[30]等研究表明，二硫键的断裂能使蛋白分子的构象发生改变，结构变得松散，更多的亲水基团暴露出来，溶解性增加。

图 6 涡流空化对大豆分离蛋白二硫键含量的影响Fig. 6 Effect of swirling cavitation on the content of disulfide bonds in SPI

2.2.5 涡流空化对大豆分离蛋白非二硫共价键含量的影响

图 7 涡流空化对大豆分离蛋白非二硫共价键含量的影响Fig. 7 Effect of swirling cavitation on the content of non-disulfide covalent bonds in SPI

由图7可知，涡流空化处理对大豆分离蛋白非二硫共价键含量的影响随处理压力的不同而不同。在0.2 MPa下非二硫共价键含量未发生显著变化（P＞0.05）；在0.4 MPa下非二硫共价键含量随处理时间的不同有不同程度的降低；在0.6 MPa下非二硫共价键含量在处理30 min后显著降低（P＜0.05）。这说明涡流空化在较高压力下产生的较强的空化效应能使大豆分离蛋白的非二硫共价键断裂。姜梅等[31]在研究高压均质对豆乳蛋白质溶解性的影响时发现高压均质产生的高速剪切、空穴和涡旋作用也使共价键断裂，蛋白质空间结构展开，水化作用增强，溶解性增加。

2.3 大豆分离蛋白溶解性与分子间作用力之间的相关性分析结果

为了探讨涡流空化处理对大豆分离蛋白溶解性改善的分子作用机制，将前期研究得到的大豆分离蛋白在涡流空化处理过程中溶解性变化的数据[13]与本研究中图3～7各分子间作用力变化的数据进行相关性分析，结果如表1所示。

表 1 大豆分离蛋白溶解性与各分子间作用力的相关性Table 1 Correlation analysis between intermolecular forces and solubility of SPI

大豆分离蛋白的溶解性与其离子键含量之间存在极显著正相关（r＝0.754）（P＜0.01），与疏水相互作用和二硫键含量之间均极显著负相关（P＜0.01），相关系数分别为-0.714、-0.839，与氢键含量和非二硫共价键含量无显著相关（P＞0.05）。由此可见，大豆分离蛋白在涡流空化处理过程中，溶解性的增加是由离子键的形成、疏水相互作用的破坏和二硫键的断裂引起的。

3 结 论

通过研究大豆分离蛋白在涡流空化处理过程中分子间作用力的变化，探讨了溶解性改善与分子间作用力变化之间的关系，得到以下结论：1）涡流空化处理过程中，大豆分离蛋白溶解性的改善不是由肽键断裂引起的；2）涡流空化处理使大豆分离蛋白的分子间作用力发生变化，其溶解性的改善是由离子键的形成、疏水相互作用的破坏和二硫键的断裂引起的。