糖蛋白130相关炎症因子介导RA患者破骨细胞分化的初步研究①

徐 鹏 邹任玲 张冬青

(上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性全身性的，以大小关节病变和关节滑膜受到炎性细胞浸润为特征，逐步形成血管翳，最终导致骨和软骨侵蚀破坏的自身免疫性疾病。其发病机制可归结于患者异常免疫学功能及其所关联的多种炎症细胞以及多种炎症因子介导了特定信号分子通路的过度活化，从而诱导患者关节病灶破骨细胞的分化，进而造成患者大小关节损伤和破坏[1,2]。糖蛋白130 (gp130)作为IL-6、IL-11和IL-27等细胞因子共同的受体β亚基，受相关配体启动激活了JAK/STAT通路，导致患者JAK/STAT相关信号分子和靶点过度活跃及IL-6受体分子也在破骨细胞表面高表达。本文旨在分析gp130相关炎症因子及介导RA患者破骨细胞增殖分化的可能机制，借以用抗gp130抗体调控gp130分子的异常表达，从而达到用免疫手段协同临床干预RA患者疾病进程的可能性。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 与上海市长宁区光华中西医结合医院合作，随机选取2014年1月至2017年6月RA患者47例作为实验组，男性15例，女性32例，年龄为(57±12)岁，病程(5±3)年，符合ACR/EULAR 2010年RA分类标准[3]。对照组选取健康献血者40例，男女各20例，年龄(45±15)岁，无慢性疾病史和长期用药史，1周内无急性感染，各关节功能正常。以上所有标本均满足血红蛋白≥100 g/L，白细胞≥3.5×109L-1，血清肌酐、血清胆红素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶不大于正常值的1.5倍[4,5]。

1.1.2主要试剂及仪器 IL-6、IL-6Rα、gp130、IL-11、IL-27和MMP-9 ELISA检测试剂盒，购自上海森雄科技实业有限公司；RPMI1640培养基，酶标检测仪购自美国Thermo Fisher公司；流式抗体同型对照及流式细胞仪购自美国BD公司；电泳凝胶转印成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1血清处理与酶联免疫法(ELISA)检测 室温凝固血清30 min，3 000 r/min离心15 min，分装EP管，-80℃冷冻保存，实验时提前取出30 min解冻。ELISA按照各试剂盒说明书操作，以IL-6为例，加入标准品和待测样品100 μl，37℃温育120 min 后洗板4次，加一抗50 μl，37℃温育60 min后洗板4次，加酶标抗体100 μl，37℃温育60 min后洗板4次，加底物显色剂100 μl，避光10 min，加终止液 50 μl，在450 nm处测吸光值。分别检测正常对照组和RA患者的血清IL-6、IL-6Rα、gp130、IL-11、IL-27和MMP-9表达量。

1.2.2破骨细胞样细胞(OLC)培养 取研究对象外周全血10 ml，用RPMI1640培养基稀释2～3倍，轻缓加入Ficoll淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，收集单个核细胞层，再以RPMI1640洗涤2次后，1 500 r/min离心10 min，重悬细胞[4,6]。将对照组和RA患者的PBMC细胞分别在添加20 ng/ml RANKL和M-CSF的RPMI1640培养基中培养3 d，再添加40 ng/ml RANKL一起培养7 d。M-CSF和RANKL每3 d补充一次，直至视野下可见大量纤维状破骨样细胞聚集。细胞以4%多聚甲醛固定，分别并进行TRAP 染色[7]和FITC-抗gp130抗体标记。

1.2.3流式细胞术(FACS)检测gp130阳性细胞 分别将正常对照组和RA患者的PBMC细胞，以及M-CSF/RANKL诱导的OLC细胞稀释成百万计数单位，取100 μl分装至流式管，各加入FITC-抗gp130抗体2 μl，4℃孵育1 h，PBS洗涤2次，用流式细胞仪进行分析，在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞群进行分选。

1.2.4抗gp130 McAb的制备(简略)与处理 通过BALB/c小鼠腹腔注射混有弗氏完全佐剂的gp130重组蛋白，第2周及4周重复加强免疫2次，第5周冲击免疫后3 d处死取脾脏研磨，以HAT选择性培养基混合脾细胞与骨髓瘤细胞，筛选出有效的细胞株经扩增纯化即为其gp130单克隆抗体[8]。在培养OLC同时单抗干预组再每3 d加50 μg/ml鼠抗人gp130单抗，其余条件不变，进行TRAP染色并进行细胞计数定量分析结果，同时分别取PBMC和OLC细胞上清用ELISA检测IL-6和MMP-9表达水平。

1.2.5免疫印迹法(Western blot)检测STAT3信号 分别将正常对照PBMC、RA患者PBMC及OLC中加入50 μg/ml抗gp130 McAb，37℃二氧化碳培养箱温育1 h，再加入10 ng/ml IL-6，37℃温育20 min 后，PBS洗涤2次，1 500 r/min离心5 min，收集细胞，提取全蛋白，加β-actin参照，Western blot检测STAT3及其磷酸化水平。

2 结果

2.1血清IL-6/IL-6Rα/gp130表达检测 经过ELISA检测显示，40例对照组IL-6、IL-6Rα、gp130血清水平分别为(18.03±4.77) pg/ml、(48.12±13.67)ng/ml、(249.66±64.99)ng/ml，47例RA患者组分别为(43.51±20.53) pg/ml、(53.26±18.36)ng/ml、(226.65±78.54)ng/ml，两组IL-6水平比较差异性有显著统计学意义(P<0.01)。虽然患者血清IL-6Rα与gp130水平差异性不显著(P>0.05)，但进一步计算成对标本的IL-6Rα/gp130后发现，与对照组相比，RA患者血清均存在IL-6Rα/gp130异常升高(0.195±0.037)vs(0.240±0.050)，差异性有统计学意义(P<0.05)(图1)。RA患者体内除了IL-6异常升高外，还可能存在IL-6Rα/gp130失衡状况。

图1 RA患者IL-6、IL-6Rα、gp130血清水平表达量及其比值Fig.1 Serum IL-6，IL-6Rα，gp130 content and ratio of IL-6Rα/gp130 in RA patientsNote: Compared with the control group,*.P<0.05；compared with the control group，**.P<0.01.

2.2血清IL-11、IL-27和MMP-9表达检测 经ELISA检测显示，47例RA患者的IL-11、IL-27和MMP-9 血清水平与40例对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 RA患者IL-11、IL-27和MMP-9的表达量Tab.1 Serum IL-11，IL-27 and MMP-9 content in RA

Note：Compared with control group,1)P<0.05，2)P<0.01.

2.3gp130阳性细胞 用FITC标记的抗gp130抗体FACS检测表明：正常人外周血PBMC(PBMC-NP)gp130阳性细胞为(1.10±0.38)%，RA患者PBMC gp130阳性细胞已达(15.12±1.97)%，差异有统计学意义(P<0.05)；经RANKL和M-CSF诱导10 d，正常人OLC具有gp130阳性细胞为(11.74±3.91)%；RA患者具有gp130阳性细胞高达(44.07±5.06)%，差异亦有统计学意义(P<0.05)(图2)。从上结果揭示RA患者淋巴细胞gp130升高，而破骨细胞表面本身可能含有丰富gp130糖蛋白。

图2 RANKL和M-CSF诱导后，对照组和RA患者的细胞中gp130的表达Fig.2 gp130 expression in cells from controls and patients with RA after induction with RANKL and M-CSFNote: The percentage of gp130-positive cells was detected.

2.4破骨细胞TRAP染色分析 当加入RANKL和M-CSF共培养3 d后显微镜下即可见细胞间隙模糊，互相融合出现多核巨细胞，边缘不规则部分出现伪足，再添加RANKL培养7 d后TRAP染色，显微镜下可见胞浆酒红色，细胞核个数大于3个，定义为TRAP+细胞，进行细胞计数定量分析，结果显示与正常对照组比较，RA患者组破骨细胞数量明显增多，具有统计学意义(P<0.05，图3)。在RANKL刺激破骨细胞同时，加入自制鼠抗人gp130 McAb，诱导分化7 d后，可见RA患者组破骨细胞数量明显减少(P<0.05，图3)。

图3 抗gp130 McAb干预破骨细胞的诱导Fig.3 Anti-gp130 McAb interfere with induction of osteoclastsNote: A.Normal-OLC;B.Normal-OLC treatment with anti-gp130 McAb;C.RA-OLC;D.RA-OLC treatment with anti-gp130 McAb;E.The expression of TRAP-positive cells in normal and RA patients 7 days after induction by RANKL and anti-gp130 McAb.*.P<0.05.

表2 RA患者细胞培养上清IL-6和MMP-9表达量Tab.2 IL-6 and MMP-9 content in supernatants of RA patients cell

Note：RA PBMC compared with NC PBMC;RA OLC compared with NC OLC;RA gp130 McAb compared with NC gp130 McAb,1)P<0.05，2)P<0.01.

2.5抗gp130 McAb干预破骨细胞上清的IL-6和MMP-9表达检测 经ELISA分别检测正常人和RA患者的PBMC，OLC和加入抗gp130 McAb共培养的OLC，结果如表2所示，正常对照组破骨细胞上清的IL-6和MMP-9均显著低于RA患者组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，加入 抗gp130 McAb干预的RA患者组破骨细胞上清的IL-6和MMP-9均显著下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4 抗人gp130单克隆抗体对RA患者细胞分泌IL-6和MMP-9的影响Fig.4 Effect of anti-human gp130 MaAb on IL-6 and MMP-9 secretion by RA cellsNote: *.P<0.05;**.P<0.01.

2.6Western blot检测RA PBMC/OLC细胞STAT3的磷酸化 IL-6结合细胞表面IL-6R/gp130可激活JAK/STAT信号通路，刺激细胞内STAT3磷酸化，20 min 即达峰值，以Western blot分别评估正常人及RA患者的PBMC和OLC细胞的抗gp130 McAb调控作用，图5表明加入抗gp130 McAb能明显抑制RA患者PBMC和OLC细胞内STAT3磷酸化。

图5 抗人gp130单克隆抗体对STAT3磷酸化的影响Fig.5 Effect of anti-human gp130 McAb on phosphoryl-ation of STAT3Note: A.Normal-PBMC;B.RA-PBMC;C.RA-OLC.

3 讨论

众所周知，IL-6和IL-11都属于白介素IL-6家族，其主要分类依据正是此类细胞因子的受体都共同含有信号传导受体亚基gp130糖蛋白。IL-6或其家族成员如IL-11与细胞膜表面或可溶性IL-6R/IL-11R的结合启动了IL-6R与gp130的结合，gp130随后进行同源二聚体化和信号转导[9,10]。而IL-27虽然属于白介素IL-12家族，由p28和EBI3组成，但其传导途径同样需要通过IL-27R与gp130组成异源二聚体[11]。研究表明，炎症反应往往由细胞因子驱动完成，而体内促炎与抗炎细胞因子的失衡往往正是诱导自身免疫疾病、慢性炎症疾病以及相关机体组织破坏的罪魁祸首[12]。实验结果IL-6与IL-11在RA患者血清的高表达提示其可能通过受体传导信号，参与RA发病进程。IL-6可诱导B细胞和T细胞增殖和分化，在滑膜病灶处，诱导VEGF分泌可促使滑膜血管新生，诱导RANKL刺激破骨细胞分化侵袭关节[13]，甚至与BMPs家族水平调节相关，使破骨细胞与成骨细胞在骨微环境失衡[14]。IL-11具有与IL-6相似可调节免疫应答和骨代谢的功能，诱导CRP等合成，且IL-11还可刺激TPO，促进血小板的增殖分化[9]，可能是RA患者往往同时伴有血小板增多症的主要因素之一。IL-27在RA患者体循环的高表达揭示了RA患者Th1/Th2的免疫失衡，IL-27体内循环调节免疫促Th1分化可上调ICAM-1在FLS表面表达，加强多种趋化因子，过度激活JAK/STAT通路，加重RA患者滑膜炎症和骨破坏[11,15]。

MMP-9作为金属基质蛋白酶的代表，参与细胞外基质代谢，作用底物Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原及明胶等，是反映骨吸收与骨重建的重要关键酶，可由破骨细胞高表达，在破骨细胞迁移、侵蚀、锚定过程起重要作用[16]。实验表明的体循环MMP-9高表达正提示了RA患者体内破骨细胞分化造成骨侵蚀的严重程度。且RA患者的IL-6、IL-11、IL-27血清学水平的异常升高，原因可能是其诱导破骨细胞分化，分泌大量金属基质蛋白酶进入体循环，表现骨侵蚀的后果。而RA患者单个核细胞上清分泌IL-6的高表达，同样揭示其可能调控淋巴细胞自分泌的IL-6诱导单核细胞融合形成多核破骨样细胞，分泌MMP-9参与骨侵蚀。

本研究检测到的血清可溶性gp130(sgp130)，可能来源于膜结合受体的蛋白分解或选择性剪接，且sgp130可能是IL-6/sIL-6Rα反式信号途径天然的拮抗剂，通过竞争结合sIL-6Rα，从而部分抑制IL-6的过度激活。本实验结果表明：RA患者细胞表面gp130大幅增加，但游离血清中的sgp130有所减少可能就在于招募了IL-6和sIL-6Rα，从而减少了反式信号转导至细胞的途径。IL-6虽有诱导破骨细胞分化等功能，但单独并无法发挥生物化功能，必须连接其受体IL-6Rα/gp130发挥作用，实验结果表明RA患者血清学IL-6Rα/gp130失衡，可导致IL-6/IL-6Rα/gp130过量反式信号传导，由于体循环存在过量的gp130相关配体，虽有血清sp130中和，但依然存在大量IL-6/IL-6Rα向膜表面gp130传导反式途径，造成JAK/STAT过度活化[17]，由此提示IL-6Rα/gp130可能是RA患者发病或病情加重的重要因素和潜在诊断手段。

体外实验通过收集PBMC，并以M-CSF和RANKL诱导后发现，同样条件下，RA患者比正常人可生成更多的破骨细胞，存在高表达的IL-6和MMP-9，且RA患者的破骨细胞表面gp130的高表达提示其可能大量招募IL-6/sIL-6Rα，从而激活STAT3，进一步诱导RANKL表达，而RANKL正是诱导破骨细胞前体的分化成熟关键，同时通过抗gp130 McAb的干预亦提示破骨细胞表面存在的gp130是其骨侵蚀发挥作用的重要靶点，阻断gp130可明显抑制下游的STAT3的磷酸化，降低细胞分泌IL-6和MMP-9的水平，证明其调控gp130确可影响RA患者的破骨细胞分化。

综上所述，本实验的研究表明RA患者中不论是IL-6和IL-11，还是IL-27，均通过多种作用机制参与RA的发病进程，且其特异性受体均需先与gp130组成同源或异源二聚体才能激活信号传导，缺乏gp130的粒细胞对IL-6并无应答[18]，gp130是RA发病机制关键信号通路的重要靶点。RA患者细胞表面gp130增多可能激活对应同源/异源二聚体受体，招募更多不仅限IL-6的相应配体诱发炎症反应加重病情。gp130和其配体们在RA患者体内循环系统和局部病灶的失衡是RA发病机制的关键，因此与检测单一细胞因子相比，监测gp130相关受体和配体的动态水平表达可能为诊断RA病程提供更好的实验室指标。

再者目前针对IL-6、IL-6R及相关激酶(JAK)等抑制剂抗体药物已经用于临床[19]，而gp130已被证明高表达于破骨细胞表面，且其受到抑制时可减少破骨细胞分化，表明gp130也将是具有发展潜力的RA治疗靶点。本项目组正在与医院研究团队合作开展应用抗gp130 mab干预RA患者的关节病灶，期待能为临床RA病程的调控增添一新的免疫干预方法。