低产尿素黄酒酵母工程菌的酿造特性

吴殿辉，李晓敏，蔡国林，孙军勇，谢广发，陆健*

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122) 2(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122) 3(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122) 4(浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州，310015)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称EC)，又名尿烷(urethane)，广泛存在于发酵食品(腐乳、酱油等)、酿造酒(黄酒、清酒、葡萄酒、苹果酒等)和蒸馏酒(威士忌、白兰地等)中[1-7]。我国黄酒中EC含量普遍高于清酒和葡萄酒，最高达1 210 μg/L[2, 8-9]。黄酒中EC含量偏高的问题由来已久，不仅带来了严峻的食品安全问题，同时也使黄酒的出口受到严重限制，是我国黄酒产业的一个重要安全隐患。因此，探索适合我国黄酒企业控制EC含量的措施，降低黄酒中EC的含量，对于我国黄酒产业的发展具有重大意义。

研究表明，发酵食品和酒精饮品中的EC主要由尿素和瓜氨酸等氨甲酰化合物与乙醇反应生成。在相同的反应条件下，黄酒中的尿素与乙醇反应形成EC的速率约为相同浓度的瓜氨酸与乙醇反应形成EC速率的3倍[10]。因此，尿素是黄酒中形成EC的主要前体物质，而黄酒中的尿素主要由酿酒酵母Saccharomycescerevisiae在发酵过程中代谢精氨酸产生[11]。酿酒酵母在精氨酸酶(由CAR1编码)的作用下降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸。尿素会在脲基酰胺酶(由DUR1,2编码)的作用下降解为NH3和CO2。因此，通过代谢工程改造敲除CAR1基因或高效表达DUR1,2基因，可以阻断酵母的尿素生成途径或强化其尿素的降解途径，从而从根源上减少黄酒发酵过程中尿素的积累和EC的形成。

本研究室在前期工作中，以黄酒工厂生产用酵母N85为出发菌株，通过食品级代谢工程改造构建了既可敲除CAR1又可高效表达DUR1,2的酵母工程菌N85DUR1,2-c。黄酒发酵实验表明，与出发菌株相比，工程菌N85DUR1,2-c所酿黄酒发酵液中尿素和EC的含量分别降低了89.1%和55.3%，且理化指标无明显差异[12]。本文研究了黄酒发酵工艺参数对工程菌N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC含量的影响，并通过50 kL的生产试验考察其发酵性能和降低黄酒中尿素和EC含量的能力，以期为工业化应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酿酒酵母S.cerevisiaeN85，由浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供的黄酒厂生产用菌株。本实验室以N85为亲本菌株，通过敲除其CAR1基因，并在DUR1,2基因起始密码子前插入酿酒酵母强启动子PGK1p，构建了低产尿素的酿酒酵母工程菌N85DUR1,2-c[12]，以上菌株均储存于本实验室。

1.1.2 酿造原料

糯米、麦曲(生麦曲和熟麦曲)均由浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供。其中，熟麦曲为接种米曲霉(Aspergillusoryzae)苏-16的纯种麦曲。

1.1.3 主要试剂

9-羟基占吨醇(≥99.0%)、氨基甲酸正丁酯(nBC，≥98.0%)、氨基甲酸乙酯(≥99.0%)以及尿素标准品(99.0%)均购于Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器

SW-CJ-IF超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；OPTIKA-B350生物显微镜，意大利MAD公司；LS-B50L自动高压蒸汽灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司；GZX-9246 MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SKY-200B恒温培养振荡器，上海苏坤实业有限公司；SHP-2500低温生化培养箱，上海精密实验设备有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪、ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色谱柱，美国Agilent公司；QP2010Ultra GC/MS气质联用仪，日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酒发酵工艺对酵母工程菌低产尿素和EC能力的影响

实验室黄酒发酵工艺流程：浸米→蒸饭→冷却→拌曲→接种→前酵→后酵→过滤澄清。按照参考文献[13]的方法，将工程菌N85DUR1,2-c与亲本菌株N85分别进行黄酒发酵，并通过单因素实验，考察酵母接种量、主酵温度和麦曲添加量对发酵液中尿素和EC含量的影响。

初始发酵工艺：酵母种子液浓度为2×107个/mL，主酵温度为30 ℃，麦曲添加量为17%(质量分数)。

1.2.1.1 不同酵母接种量对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

将亲本菌株N85和工程菌N85DUR1,2-c的种子液浓度分别稀释成0.5×107、1×107、2×107、3×107、4×107个/mL，100 g糯米的黄酒发酵体系中分别添加5种不同浓度的酵母种子液5 mL，其他发酵工艺参数不变，考察经不同酵母接种量进行黄酒发酵后发酵液中尿素和EC的含量。

1.2.1.2 不同主酵温度对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

其他发酵工艺参数不变，考察主酵温度分别为24、27、30、33、36 ℃时黄酒发酵液中尿素和EC的含量。

1.2.1.3 不同麦曲添加量对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

其他发酵工艺参数不变，考察麦曲添加量分别为11%、14%、17%、20%、23%时黄酒发酵液中尿素和EC的含量。

1.2.2 黄酒大生产试验

参考某绍兴黄酒厂的实际生产工艺，将工程菌N85DUR1,2-c在酒厂进行50 kL发酵罐的生产试验，考察工程菌的生长和发酵性能以及黄酒发酵液的各项理化指标。

1.2.3 黄酒发酵液常规理化指标的测定

黄酒发酵液中酒精、总糖、pH值、总酸、氨基酸态氮等含量的测定参考黄酒国标GB/T 13662—2008的测定方法[14]。

1.2.4 黄酒中尿素含量的检测

采用高效液相色谱法，结合荧光检测器测定黄酒中尿素的含量[15]。

1.2.5 黄酒中EC含量的检测

以nBC为内标，采用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS)测定黄酒中EC的含量[5]。

1.2.6 黄酒发酵液贮存过程中EC含量变化的预测

参照黄酒中EC生成动力学方程W=2.950×1019×e-14551/T×S0×t，预测黄酒发酵液在贮存过程中EC含量的变化。其中EC的生成量(W)与黄酒中尿素初始浓度(S0)、贮存时间(t)和热力学温度(T)成正比[16]。

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1.2.7 数据分析

所有实验数据进行3次测定，运用SPSS 19.0软件进行方差计算和差异性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺对酵母工程菌低产尿素和EC能力的影响

2.1.1 酵母接种量对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

传统绍兴黄酒发酵时，酵母的数量和质量会影响黄酒的出酒率和风味。此外，黄酒酿造是淀粉糖化和酵母发酵同时进行的过程，因此，控制合适的酵母接种量尤为重要。既要保证发酵醪液中的糖分足够酿酒酵母生长和发酵所需，又要保证有足够数量的酿酒酵母可以及时利用糖化形成的营养物质，从而避免糖分的积累和高渗透压的出现，影响酿酒酵母的生长和发酵性能。由图1可知，酵母接种量不同时，工程菌N85DUR1,2-c和亲本菌株N85发酵液中尿素和EC的含量均没有变化，说明酵母接种量在(0.5～4)×107个/mL时对黄酒发酵液中尿素和EC的含量基本无影响。

A- 尿素；B- EC图1 酵母接种量对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响Fig.1 Effect of yeast inoculation amount on urea and EC content in fermented Huangjiu sample

2.1.2 主酵温度对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

由图2可知，主酵温度不同时，工程菌N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量没有变化，说明主酵温度对工程菌降低发酵液中尿素含量的能力无影响。而亲本菌株N85在较低温度(24 ℃)和较高温度(33 ℃和36 ℃)时，发酵液中尿素和EC的含量较低，主酵温度为27 ℃和30 ℃时发酵液中尿素和EC的含量较高。这是因为，酿酒酵母在24 ℃时生长代谢缓慢，发酵以较慢的速度进行，因而代谢精氨酸产生的尿素含量也低。而在27 ℃和30 ℃时，酿酒酵母生长速度加快，糖化与发酵保持良好的平衡，酿酒酵母在代谢精氨酸的同时会产生尿素，使发酵液中尿素的含量增加。当主酵温度在33 ℃以上时，发酵醪液中存在的霉菌和细菌基本处于最适生长温度，大量分泌蛋白酶和淀粉酶等水解酶系，在发酵初期即将大分子物质迅速降解为可供酿酒酵母生长和发酵所需的营养物质。大量偏好型氮源(丝氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸等)[17]的存在使得酿酒酵母对精氨酸的利用减少(图3)，从而减少了发酵液中尿素的含量以及EC的形成。

A- 尿素；B- EC图2 主酵温度对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the concentr-ations of urea and EC in the fermented Huangjiu sample

图3 不同发酵温度下黄酒发酵液中氨基酸含量的检测Fig.3 Detection of amino acids contents in Huangjiusample fermented at different fermentation temperature

2.1.3 麦曲添加量对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

A- 尿素；B- EC图4 麦曲添加量对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响Fig.4 Effect of wheat Qu amount on the concentrationsof urea and EC in the fermented Huangjiu sample

图5 不同麦曲添加量黄酒发酵液中氨基酸的含量Fig.5 Detection of amino acids contents in Huangjiusample fermented with different amounts of wheat Qu

以上单因素实验结果表明，黄酒发酵过程中主酵温度、接种量和麦曲添加量等主要工艺参数对工程菌N85DUR1,2-c低产尿素和EC的能力均无影响，且含量低于亲本菌株，说明工程菌N85DUR1,2-c在不同的发酵工艺条件下都可以有效地降低发酵液中尿素和EC的含量。这是因为CAR1基因的敲除阻断了工程菌代谢精氨酸生成尿素的途径，DUR1,2基因的高效表达强化了尿素的降解途径，因此，工程菌在黄酒发酵过程中不仅不产生尿素还能高效地降解原料中带入的尿素，最终减少黄酒发酵液中尿素和EC的积累。

2.2 酵母工程菌在黄酒工厂生产试验中的酿造特性

2.2.1 酵母工程菌对黄酒发酵液理化指标的影响

将二倍体黄酒酵母工程菌N85DUR1,2-c与亲本菌株N85在黄酒厂分别进行50 kL的黄酒生产试验，考察工程菌在工厂实际生产条件下的发酵性能。由发酵液中理化指标检测结果(表1)可知，工程菌与亲本菌株发酵液中酒精含量基本相同，说明其发酵能力与亲本菌株基本没有差异。另外，发酵结束后酒液中总糖、总酸和氨基酸态氮含量以及pH值基本相同，符合黄酒国标标准。

表1 黄酒发酵液理化指标的测定Table 1 Measurement of metabolites contents in Huangjiusample fermented by different strains

注：同一行中，均与N85的数据相比，*，表示对应P<0.05差异的显著性，不标注者表示差异不显著(P<0.05)(下同)

由表2和表3可知，生产试验发酵液中氨基酸和主要风味物质含量的检测结果与先前实验室三角瓶发酵实验结果基本一致[12]。由于DUR1,2的高效表达促进了工程菌N85DUR1,2-c对尿素的利用，对天冬氨酸、谷氨酰胺等偏好型氮源的利用相对减少，所以，工程菌发酵液中天冬氨酸和谷氨酰胺的含量稍高于N85。同时，由于CAR1的敲除，使得N85DUR1,2-c对精氨酸的利用能力降低，所以其发酵液中精氨酸含量高于N85，而由精氨酸降解生成的鸟氨酸的含量也随之减少。此外，精氨酸利用率的降低会促使黄酒发酵液中高级醇含量的下降[18]。因此，与亲本菌株N85相比，N85DUR1,2-c发酵液中异戊醇和异丁醇的含量略低。而高级醇，尤其是异戊醇是黄酒中引起“上头”的主要物质，高级醇含量的降低使得黄酒中风味物质更加协调、柔和[19]。另外，2个菌株发酵液中其他醇类、醛类、酸类和酯类等挥发性风味物质的含量没有明显差异。

表2 黄酒发酵液中氨基酸含量的比较单位：mg/L

表3 黄酒发酵液中风味物质含量的比较单位：mg/L

2.2.2 酵母工程菌对黄酒发酵液中尿素和EC含量的影响

将2个酵母菌株黄酒生产试验的发酵液进行尿素和EC含量的检测，结果如表4所示，工程菌N85DUR1,2-c发酵液中尿素含量仅为(2.4±0.2) mg/L，与亲本菌株相比，尿素降低了90.7%。同时，N85DUR1,2-c发酵液中EC含量降低了54.6%，仅为(14.9±0.6) μg/L，而且发酵液经过90 d室温贮存后EC含量仅增加34.9%，为(20.1±0.4) μg/L，而N85发酵液经过90 d贮存后EC含量达到(70.3±1.6) μg/L，增幅达114.3%。这是因为CAR1基因的敲除和DUR1,2基因的高效表达，不仅阻断了工程菌N85DUR1,2-c代谢精氨酸生成尿素的途径，而且增强了其对发酵醪液中尿素的利用能力，从而大大降低了黄酒发酵液中尿素的含量，前体物含量的降低也就使得发酵液在贮存过程中形成EC的数量减少，增幅缓慢。

表4 黄酒发酵液中尿素和EC含量的比较Table 4 Comparison of urea and EC contents in Huangjiusample fermented by different strains

注：同一列中，所有数据均与N85的数值相比；*，表示对应P<0.001差异的显著性

2.3 黄酒发酵液贮存过程中EC含量变化的预测

在黄酒生产过程中，大部分EC主要在煎酒、灭菌等高温工段以及长时间储酒过程中形成，发酵过程中形成的EC是很有限的[20-21]。尿素是黄酒中形成EC的主要前体物质，尿素含量的高低以及与酒精发生反应时间的长短与黄酒中EC的含量呈正相关[16]。因此，本论文构建的酵母工程菌N85DUR1,2-c可以大幅度地降低发酵液中尿素的含量，不仅能够减少黄酒发酵过程中EC的形成也可以减少长时间储酒过程中EC的增加量。以50 kL黄酒生产试验的发酵液为研究对象，通过黄酒中EC形成的动力学方程预测发酵液在25℃贮存过程中EC含量的变化。由表5结果所示，利用EC动力学方程预测的N85和N85DUR1,2-c发酵液贮存90 d后EC含量分别为76.3 μg/L和19.0 μg/L，与上文直接测定结果的趋势基本一致，说明该动力学方程可用。由预测结果可知，贮存1 年后，N85和N85DUR1,2-c发酵液中EC含量分别为209.2 μg/L和31.2 μg/L，增幅为537.9%和110.6%，工程菌发酵液在贮存过程中EC含量增加幅度远小于亲本菌株N85。而且贮存3 年、5 年、10 年和30 年后，N85DUR1,2-c发酵液中EC的含量仅为N85发酵液中EC含量的10%左右。此外，尿素在长时间储存过程中也会逐渐降解，浓度会有所降低，实际生成的EC量要低于预测值。因此，尿素浓度的降低大大减少了长时间储酒过程中EC的形成，提高了黄酒的饮用安全性。

表5 黄酒发酵液贮存过程中EC含量的预测Table 5 Prediction of EC contents in Huangjiu sample during storage

注：yr，年同一列中，所有数据均与N85的数值相比；*，表示对应P<0.001差异的显著性

3 结论

本研究室在前期研究中利用食品级代谢工程改造并构建了低产尿素的酵母工程菌N85DUR1,2-c，(1)黄酒发酵工艺参数的改变对工程菌N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量基本没有影响，而不同主酵温度和麦曲添加量会显著影响亲本菌株N85发酵液中尿素和EC的含量。说明工程菌N85DUR1,2-c在不同的发酵工艺条件下均可以有效地降低发酵液中尿素和EC的含量。(2)50 kL黄酒生产试验表明，工程菌N85DUR1,2-c发酵性能与亲本菌株N85基本没有差异。与亲本菌株N85相比，N85DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别降低了90.7%和54.6%，而且在长时间贮存过程中EC的含量增加缓慢，提高了黄酒的饮用安全性。