不同酿酒酵母对威代尔冰葡萄酒挥发性组分的影响

2020-02-29张小倩马玥徐岩李记明唐柯

食品与发酵工业 2020年3期

张小倩，马玥，徐岩，李记明，唐柯*

1(教育部工业生物技术重点实验室(江南大学)，江苏无锡，214122) 2(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)，江苏无锡，214122)3(江南大学生物工程学院，酿酒微生物与酶技术研究室，江苏无锡，214122)4(烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东烟台，264000)

冰葡萄酒是利用气温在-8 ℃以下，葡萄树上自然冰冻的葡萄，在低温条件下压榨、发酵而成的甜型葡萄酒[1]。独特的酿造工艺，使得冰葡萄酒具有浓郁的蜂蜜、杏、焦糖等香气特征[2]。酵母作为发酵过程中影响冰葡萄酒香气的重要因素[3]，可以合成醇类、酯类等化合物，进而影响葡萄酒的香气特征[4]。SYNOS等[5]使用4种酵母(V1116、EC1118、VL1、自然发酵)进行冰酒发酵，发现利用EC1118和自然发酵的冰葡萄酒中香气化合物种类最多。CRANDLES等[6]发现，除苯乙酸乙酯、葡萄烷、4-乙烯基愈创木酚和1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘外，其他化合物在EC1118发酵的冰葡萄酒中含量高于自然发酵的冰葡萄酒。申静云等[7]研究了非酿酒酵母和酿酒酵母混合发酵对威代尔冰葡萄酒香气的影响，确定Hanseniasporaopuntiae更适合应用于冰葡萄酒发酵。

葡萄酒中香气化合物种类多，浓度跨度大，鉴定过程困难繁琐。目前，多用气相色谱法(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)分析葡萄酒中的香气化合物[8-10]。但是该方法存在共流出色谱峰现象，会干扰化合物的鉴定；且不能够检测出部分微量或痕量成分[11]。近年来，全二维气相色谱与飞行时间质谱法，因其峰容量、灵敏度、选择性和分辨率高而越来越多地被采用。采用GC×GC-TOFMS分析后，对获得的大量数据进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚类分析(cluster analysis,CLA)、判别分析(discriminant analysis,DA)和Fisher比率[12]等化学计量学分析，可更好地挖掘样品的特征[13]。如WELDEGERGIS等利用GC×GC-TOFMS对南非葡萄酒品种皮诺塔吉的化学成分进行的研究，得到了该品种香气化合物详细的表征[14]；而顶空固相微萃取技术与GC×GC-TOFMS系统结合，可以轻松地分离和鉴定葡萄酒香气中的多种极性和非极性有机化合物，克服了样品复杂性和共流出问题，能够快速评价不同贮藏条件下葡萄酒的香气特征[15]；因此GC×GC-TOFMS也成为分析复杂葡萄酒样品香气成分差异的首选分析工具，它可以更加全面地解析葡萄酒挥发性化合物的特征。

本研究采用HS-SPME结合GC×GC-TOFMS解析不同酵母发酵的威代尔冰葡萄酒的挥发性化合物，进一步比较不同酵母发酵冰葡萄酒挥发性组分的差异及特征。本项研究不仅可对后续深入研究酵母发酵冰葡萄酒的呈香机理提供理论基础，同时对冰葡萄酒的发酵调控也具有良好的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

本研究样品由张裕葡萄酿酒股份有限公司提供，采用2018年威代尔冰葡萄原料[压榨后葡萄汁总糖380.5 g/L，总酸9.1 g/L(酒石酸计)]，分别由ST、K1、R2、EC1118四种用于冰葡萄酒发酵的商业酵母酿造而成的冰葡萄酒。

1.1.2 试剂与仪器

NaCl(化学纯)，中国医药集团化学试剂有限公司； C7-C30直链正构烷烃、2-甲氧基-D3-苯酚、色谱级乙醇，美国 Sigma-Aldrich 公司。

MPS2多功能自动进样系统，德国Gerstel 公司； DVB/CAR/PDMS三相萃取头(2 cm 50/30 μm),美国Supelco Inc.；Pegasus®4D全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GC-TOFMS)美国LECO Corp.；DB-FFAP型GC-MS色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm), 美国Agilent Technologies；Rxi-17Sil MS二维色谱柱(1.5 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Restek公司。

1.2 实验方法

1.2.1 顶空固相微萃取实验方法

实验方法参照本实验室前期优化建立的方法并加以改进[16]。将5 mL冰葡萄酒样品及1.5 g NaCl置于20 mL顶空瓶中，并添加10 μL 内标(2-甲氧基-D3-苯酚，终质量浓度为609.76 μg/L)，用带PTFE/蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密封后，由多功能自动进样系统MPS2 进行HS-SPME操作。样品在50 ℃下平衡5 min，萃取45 min，转速设置为250 r/min。萃取完成后，吸附有挥发性化合物和半挥发化合物的萃取头于GC 进样口，在250 ℃下解吸附5 min，不分流，进行GC×GC-TOFMS 分析。相同条件下每个样品各进样3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS 分析方法及质谱条件

GC×GC-TOFMS分析方法及质谱条件参照本实验室前期优化建立的方法[17]。GC-MS柱温箱升温程序：起始温度45 ℃保持2 min，以4 ℃/min的速率升温至230 ℃并保持15 min。调制器调制时间4 s，热调制时间为1 s，调制补偿温度为20 ℃。二维柱温箱升温程序：起始温度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至250 ℃并保持5 min。以高纯氦气(>99.999 5%)作为载气，恒流模式，流速：1 mL/min。

飞行时间质谱条件：采用EI离子源，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃，电压控制70 eV。检测器采集质量数范围35～400 amu，采集频率100 spectrum/s，检测器电压430 V。数据由LECO公司Pegasus 4D工作站采集。

1.2.3 数据处理

不同酵母发酵冰葡萄酒样中挥发性化合物鉴定：利用仪器自带ChormaTOF软件对采集的数据进行解析，色谱峰的峰宽分别设为24 s和0.2 s，自动识别信噪比大于50的色谱峰后进行自动积分解卷积和质谱库(NIST14，Wiley 9)比对。利用ChromaTOF软件统计比较功能(statistical comparison)处理，峰对齐后，筛选策略参考刘志鹏等的方法[18]，选择3个平行样品中出现1次的峰作为这类酒样中存在的组分。筛选相似度大于700的组分，并剔除没有风味贡献的烷烃类化合物和色谱柱流出物含硅类化合物等，作为初步鉴定结果。在此基础上，相同条件下分析一系列正构烷烃(C7-C30)确定每个化合物的GC-MS色谱柱保留指数，并与文献报道的保留指数比对确认，偏差在30以内的化合物作为最终定性的结果[19]。

运用MICROSOFT EXCEL 2013程序对不同酵母发酵的威代尔冰葡萄酒中挥发性化合物定量数据进行计算，运用SPSS STATISTICS 22进行主成分分析(PCA)、数据标准化，运用HEML 1.0绘制热图。

2 结果与讨论

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS 技术解析冰葡萄酒中挥发性组分

通过GC×GC-TOFMS在不同酵母发酵的酒中共分离检测到3 784个色谱峰，图1-A展示了R2酵母发酵冰葡萄酒中挥发性组分的全二维分析的色谱图，从图1-B中可以看出，4-甲基-1-戊醇、1-丁醇、戊酸乙酯这3种化合物在一维共流出，很难定性定量分析，但在二维色谱得到了很好地分离。图1-C展示了这3种化合物的质谱匹配。

图1 R2酵母发酵冰葡萄酒中挥发性组分的全二维分析总离子流图(A)及节选1个调制周期3个化合物色谱峰(B)和质谱图(C)Fig.1 Analytical ion chromatogram contour plot analysis of volatile components in icewine fermented R2 yeast (A) andmodulated peaks of there compounds found in this icewine(B) and deconvoluted mass spectra of 3 compounds(C)

针对ChromaTOF软件解图后的数据，通过上述数据处理方法，最终在四种不同酵母冰葡萄酒样中共定性出485种化合物(酯123种、萜烯26种、醇105种、羰基化合物115种、呋喃类23种、含氮化合物21种，挥发酚类19种，含硫化合物7种，芳香族化合物35种，内酯类11种)，秦绍智等[20]利用液-液萃取法结合GC-MS分析，在威代尔冰葡萄酒定性出59种挥发性物质，王蓓等[21]利用运用搅拌棒吸附萃取-气相色谱/质谱联用技术在威代尔冰葡萄酒定性出109种挥发性物质，检出数量还是远低于本研究，也表明GC×GC-TOFMS在挥发性化合物分离与鉴定上具有很大优势，可以更加全面的认识冰葡萄酒香气。

对不同酵母发酵威代尔冰葡萄酒样中挥发性化合物进行统计，其中共有的化合物347种，占总挥发性化合物总数的72%。具体化合物统计结果如表1。从表1中我们可以看出不同酵母发酵的冰葡萄酒化合物差异主要集中在酯类、醇类及羰基化合物这3类酵母发酵产物上，这一结果也与其他冰葡萄酒研究一致[5-6]。

表1 不同酵母发酵冰葡萄酒GC×GC-TOFMS挥发性化合物种类Table 1 Table of volatile compounds in icewine fermentedby different yeasts

将定性出化合物的峰面积与内标物相比，得到半定量结果，利用标准化后的数据进行PCA分析，如图2所示，2个主成分变量总计代表了总变量的72.33%，其中PC1解释了总变量的45.29%，PC2解释了27.03%。根据4种酵母发酵的威代尔冰葡萄酒的挥发性组分进行PCA分析得到了很好地区分，表明不同酵母发酵的酒样挥发性化合物在种类和含量上存在其特征性。

图2 不同酵母发酵冰葡萄酒主成分分析图Fig.2 Principal component analysis of different yeastfermented icewines

在定性得到的挥发性化合物基础上，结合香气物质数据库(http://www.flavornet.org/flavornet.html)筛选出156个具有香气特征的挥发性化合物进一步分析，根据半定量数据绘制热图(图3)。

由图3所示，156种化合物根据其在不同酒样中含量差异分为3个区域，其中A区域物质在R2酵母发酵的酒中含量高，B区域在ST酵母中含量最高，而C区域则在K1、EC1118酵母中含量最高。在A类化合物中，聚集了大部分的酯类、羰基化合物类、醇类和萜烯类化合物，其中1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮呈现为蘑菇味；1-己醇、β-大马士酮、里那醇、香叶醇，表现为花香；辛酸乙酯、己酸乙酯，具有果香[22-23]； 1-庚醇为草药味，这些化合物都是威代尔冰葡萄酒中报道过的关键香气物质[16, 24]，B类主要是芳香族化合物和酯类化合物，其中乙酸苯乙酯(蜂蜜、玫瑰香气)、酱油酮(甜香)、戊酸乙酯(果香)也都被报道为冰酒中的重要香气化合物。C类化合物中聚集了全部的内酯类化合物，这些内酯类化合物普遍具有水果香和甜香。由以上分析可知，R2酵母发酵的冰葡萄酒中关键香气如1-辛烯-3-醇、1-己醇、β-大马士酮、里那醇、香叶醇、1-辛烯-3-酮等香气物质含量明显高于其他酵母，且其醇类、酯类、羰基化合物的含量上具有明显优势。

3 结论

本研究利用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析了4种不同酵母发酵的威代尔冰葡萄酒样的挥发性组分，通过质谱库与保留指数比对相结合，并利用ChormaTOF软件的统计比较功能，最终定性出485种挥发性组分，其中共有挥发性化合物347种。通过与香气数据库比对，共找到156种具有香气特征的物质，进一步通过热图分析可以看出，R2酵母在酯类、醇类、萜烯类等化合物上具有显著优势，ST酵母在芳香族化合物上具有优势，K1与EC1118酵母的内酯类化合物含量明显高于其他酵母。