聚L-瓜氨酸修饰电极电化学测定食品中曲酸

邵东旭，马心英，信明浩，王瑞

(菏泽学院 化学化工学院，山东 菏泽，274015)

曲酸(kojic acid)于1907年由斋藤在米曲霉酿造酱油中发现，1912年被命名为曲酸，1924年首次确定曲酸的结构。其化学名称为5-羟基-2-羟甲基-4-吡喃酮, 为无色棱柱状晶体, 易溶于水、醇、丙酮, 微溶于醚、乙酸乙酯、三氯甲烷和吡啶, 不溶于苯[1]。

曲酸产生自微生物的发酵过程，是一种有机酸，常见于豆瓣酱、酒类、醋等酿造食品。由于曲酸具有酪氨酶的抑菌能力和抗氧化性，所以常在食品、药品、化妆品的加工中用作防腐剂、保鲜剂、抗氧化剂等，应用较为广泛[2-5]。曲酸安全性的相关研究也越来越受到研究人员的关注, 对其毒性进行研究表明，长期食用可损害人体甲状腺，甚至引发肿瘤[6-8]。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构已将曲酸列为3类致癌物。

目前检测曲酸成熟的方法主要有气相色谱法[9]、近红外光谱[10]、高效液相色谱法[6,11-13]、超高效液相色谱法[14]、电化学方法[15-16]等。与电化学检测方法相比，其他几种方法样品预处理繁琐，操作步骤复杂，检测环境要求严格，费用高，而氨基酸特有的官能团(如羧基和氨基)聚合在玻碳电极表面后，具有良好的电催化特性，可以改善电极的稳定性和重现性[17-19]，因此利用氨基酸修饰电极检测食品中的曲酸有实际意义。笔者制备了L-瓜氨酸修饰电极，研究了曲酸在该电极上的电化学行为，并应用于食品中曲酸含量分析，方法简单、快速，准确度和灵敏度较高。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站，上海辰华仪器有限公司；GCE玻碳电极, 上海仪电科学仪器股份有限公司;三电极体系:饱和甘汞电极电极(SCE)为参比电极，铂电极(上海仪电科学仪器股份有限公司)为对电极，聚L-瓜氨酸修饰电极(PLC/GCE，自制)为工作电极；SYZ-550型石英亚沸高纯水蒸馏器，金坛市晶玻实验仪器厂；KH-100DB型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；ESJ180-4电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；85-1型恒温磁力搅拌器，深圳天南海北有限公司；微量进样器,上海高鸽工贸有限公司。

L-瓜氨酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，配制成标准溶液(1.0×10-3mol/L)；曲酸(AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，配制成标准溶液(1.0×10-3mol/L)；PBS缓冲溶液(由磷酸氢二钠和柠檬酸配制而成，AR，天津市科密欧化学试剂有限公司)；黄豆酱、味极鲜酱油、陈酿醋，购自超市；实验过程中用水均为二次蒸馏水。

1.2 聚L-瓜氨酸修饰电极的制备

在涂有Al2O3粉末的湿润麂皮上将玻碳电极(GCE)的表面打磨抛光后用二次蒸馏水冲洗干净，依次在超声波清洗器中用硝酸(1∶1，体积比)、无水乙醇、二次蒸馏水充分清洗30 s左右后，用二次蒸馏水冲洗干净。再将打磨好的GCE放入1.0×10-4mol/L的L-瓜氨酸(pH=7.0)溶液中，实验选择循环伏安法(CV)在-1.5～2.3 V电位范围内，以10 mV/s的扫描速率扫描6段，聚合完成后取出电极，用二次蒸馏水淋洗电极表面，即制得PLC/GCE。

1.3 实验方法

将三电极体系置于pH=4.0的PBS缓冲溶液中，在0.0～1.5 V电位范围内，以100 mV/s的扫描速率对一定浓度的曲酸溶液进行(CV)扫描，根据测得曲酸的氧化峰电流(ipa)与其浓度(c)所成的线性关系，实现样品中曲酸的定量分析。

1.4 样品预处理

黄豆酱：称取已在研钵中充分研磨过的黄豆酱9.5 g，加水稀释搅匀后，使用真空抽虑泵抽滤，并用二次水冲洗滤纸上的残渣2遍，将滤液转移至250 mL容量瓶中，定容后放置冰箱中冷藏，即制得黄豆酱样品溶液。取9.00 mL上述溶液，加入0.5 mL 0.03 mol/L EDTA 溶液掩蔽酱油样品中存在的金属离子，用0.5 mL质量分数为1%的Na2SO3还原溶液中的氧化性物质，10 mL pH=4.0的PBS缓冲溶液，制得样品待测液备用。

酱油：将酱油样品用真空抽滤泵抽滤，以过滤不溶性杂质，取0.5 mL酱油样品，加入10 mL pH=4.0的PBS缓冲溶液、0.5 mL 0.03 mol/L EDTA 溶液、0.5 mL质量分数为1%的Na2SO3和9.5 mL H2O，制得待测液。

醋：向1 mL醋中加入3 mL pH=4.0的PBS缓冲溶液、0.25 mL 0.03 mol/L EDTA 溶液、0.25 mL质量分数为1%的Na2SO3和2 mL H2O，制得待测液。

2 结果与讨论

2.1 聚L-瓜氨酸修饰电极的最佳聚合条件

2.1.1L-瓜氨酸溶液pH的选择

在-1.5～2.2 V的扫描电位范围、扫描速度为100 mV/s、扫描段数(n)=10的实验条件下，改变L-瓜氨酸溶液的pH分别为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0进行聚合实验，分别用不同pH条件下制得的PLC/GCE测定相同浓度曲酸溶液。结果表明，当瓜氨酸溶液pH=7.0时，所制备的修饰电极测定曲酸的氧化峰电流最大，因此选择pH7.0的L-瓜氨酸溶液做为聚合底液。

2.1.2 聚合扫描段数(n)的选择

固定电位范围为-1.5～2.2 V，扫描速度为100 mV/s，L-瓜氨酸溶液pH=7.0，改变聚合扫描段数(n)进行实验。结果表明，当n=6时，所制备的修饰电极测定曲酸的氧化峰电流最大，这是因为随着n的增加氨基酸在电极上形成的膜趋于完整，对曲酸的响应电流逐渐增大；但随着n的持续增加，膜厚增加，电子在膜中阻力变大, 导致响应电流降低[20]。故本论文中n选择6。

2.1.3 聚合扫描速度(v)的选择

L-瓜氨酸在电极表面的聚合反应中，扫描速度会影响膜的平整性、致密性, 直接影响到测定效果[20]。在-1.5～2.2 V的扫描电位、溶液pH=7.0、扫描段数n=6的实验条件下，改变聚合电极时的扫描速率v进行实验，结果表明当v=10 mV/s时，曲酸在所制备的修饰电极上氧化峰电流最大。

2.1.4 聚合扫描电位的选择

在溶液pH=7.0、v=10 mV/s、n=6的条件下，分别改变聚合时的扫描高、低电位以确定电位范围，结果表明当电位范围在-1.5～2.3 V时，所制备的修饰电极对曲酸催化效果最好。

图1为在最佳条件下L-瓜氨酸聚合的伏安曲线，由图1可见，随着扫描段数的增加，氧化峰和还原峰电流增加的幅度减小，聚合结束后可观察到电极表面有深蓝色的膜存在。

图1 L-瓜氨酸在玻碳电极上聚合伏安曲线Fig.1 The voltammetry curve of L-citrulline polymeri-zation on glassy carbon electrode

2.2 曲酸在PLC/GCE上的电化学行为

利用PLC/GCE分别测定了空白溶液、曲酸溶液的CV行为以及GCE测定了曲酸溶液的CV图，所得循环伏安曲线如图2所示。可见PLC/GCE在空白溶液无峰电流响应(图2-a)，说明空白溶液组分对测定无干扰，且聚L-瓜氨酸在空白溶液中不产生氧化还原峰；使用GCE对曲酸溶液进行测定时的ipa=1.67 μA，氧化峰电位(Epa)=1.08 V(图2-b)；而PLC/GCE对同一浓度曲酸溶液进行测定时ipa=18.98 μA，Epa=1.07 V(图2-c)，此时ipa较使用GCE时增加了约11倍，而且峰电位略微负移，说明聚合在电极表面的聚L-瓜氨酸膜对曲酸的氧化具有电催化作用。此外曲酸在反应过程中只产生1个氧化峰，说明曲酸在修饰电极上的反应是一不可逆过程。

图2 PLC/GCE测定空白溶液(a)、GCE测定曲酸溶液(b)、PLC/GCE测定曲酸溶液(c)的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms of blank solution determinedby PLC/GCE(a), kojic acid solution determined by GCE(b),kojic acid solution determined by PLC/GCE(c)

2.3 测定曲酸的最佳实验条件

2.3.1 溶液酸度的影响

保持0～1.5 V的扫描电位、100 mV/s的扫描速度等实验参数不变，测定不同pH的曲酸溶液的ipa。由图3可见，当pH=4.0时，曲酸的ipa最大，故本论文中曲酸溶液的最佳测定pH为4.0。结果还表明，随着pH值的升高，曲酸的Epa逐渐负移，且Epa与pH呈线性关系(线性关系如图4所示)，其方程为：Epa(V)=1.33～0.067 pH(相关系数R=0.998 5)，线性方程的斜率为0.067 mV/pH，接近0.059，说明质子参与了曲酸在修饰电极表面上的氧化反应，且质子转移数等于电子转移数，其可能电极反应式如下式(1)所示。

自a到g的pH：2.2、3.0、4.0、5.0、 6.0、7.0、8.0图3 曲酸在PLC/GCE上随pH变化的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of kojic acid on PLC/GCEwith change of pH

图4 Epa与pH的线性关系Fig.4 Linear relationship between Epa and pH

2.3.2 扫描速度(v)的选择

固定曲酸溶液pH=4.0，扫描电位范围为0.0～1.5 V，讨论扫描速度对曲酸ipa的影响。结果表明，曲酸氧化峰电流随扫描速度在20～300 mV/s范围内不断增大而增大，而且ipa与扫描速度呈线性关系(如图5所示)，线性方程为：ipa(μA)=5.50+0.056v(mV/s)，R=0.995 2。表明曲酸在聚L-瓜氨酸修饰电极上的电化学行为是由吸附控制过程的。由图6可知，当扫描速度v=100 mV/s时，氧化峰峰形较好，灵敏度较高，故本文中测定曲酸溶液时的扫描速度为100 mV/s。

图5 曲酸在PLC/GCE上的ipa随扫描速度的变化关系Fig.5 The change of ipaon PLC/GCE with scan rate

自a到o：20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300 mV/s图6 曲酸在PLC/GCE上随扫描速度变化的循环伏安图Fig.6 cyclic voltammograms of kojic acid with scan rateon PLC/GCE

2.3.3 测定电位范围的影响

保持曲酸溶液pH=4.0、扫描速度为100 mV/s，讨论测定时扫描电位对曲酸的氧化峰电流的影响。实验结果表明，当高电位为1.5 V，低电位0.0 V时所测得的曲酸氧化峰电流值最大，故本论文的最佳扫描电位范围为0.0～1.5 V。

2.4 工作曲线及方法重现性

在测定曲酸的最佳实验条件下，用PLC/GCE测定不同浓度曲酸的CV曲线示于图7。

自a到i: 8、10、20、40、60、80、100、160、280 μmol/L图7 不同浓度的曲酸在PLC/GCE上的循环伏安曲线Fig.7 CV curves of kojic acid of different concentration onPLC/GCE

当曲酸浓度增加到4.00×10-6mol/L时出现第一个氧化峰，所以本论文中测定曲酸溶液的检出限为4.00×10-6mol/L。当浓度在8.00×10-6～2.80×10-4mol/L的范围内与ipa有良好的线性关系(如图8所示)，线性方程为：ipa(A)=1.03×10-6+0.060c(mol/L)，相关系数(R)为0.995 5。

c(曲酸)分别为8、10、20、40、60、80、100、160、280 μmol/L图8 曲酸的浓度与其在PLC/GCE上的氧化峰电流的关系曲线Fig.8 Curve of the concentration of kojic acid and itsoxidation peak current on PLC/GCE

2.5 干扰实验

2.6 样品中曲酸含量测定

用制备的PLC/GCE在测定曲酸溶液的最佳实验条件下对黄豆酱、醋和酱油样品待测液进行回收率实验，结果如表1所示。

表1 待测样品中曲酸的测定(n=3)Table 1 Determination of kojic acid in the sample tobe tested(n=3)

经计算黄豆酱中曲酸的含量为0.75 mg/g、醋中曲酸含量为0.029 mg/mL、酱油中曲酸的含量为0.58 mg/mL。

3 实验结论

本文制备了PLC/GCE，获得了修饰电极的最佳制备条件和测定曲酸溶液的最佳实验条件，用PLC/GCE在最佳实验条件下对曲酸含量进行CV测定。曲酸在8.00×10-6～2.80×10-4mol/L浓度范围内与其氧化峰电流呈较好的线性关系，样品回收率为98.9%～104.2%, 该方法重现性、稳定性良好，可用于黄豆酱、酱油和醋样品中曲酸的测定，建立了测定食品中曲酸含量的新方法。