RT-PCR结合高分辨率熔解曲线对两种致病菌的快速检测

姚艳玲

（嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴314050）

近年来，生食海产品、果蔬沙拉、水果饮料等现制现售即食类食品因其鲜嫩的口感、丰富的营养在餐桌上频频出现，且备受欢迎。但由于其未经熟制加工，存在致病菌污染风险。而金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌是肉类、奶类、果蔬等食品中常见的污染致病菌，易感人群尤其容易感染[1-2]。其中金黄色葡萄球菌产生的肠毒素能引起食物中毒[3]，据报道，每100 g食物中含有不足18 μg 的肠毒素便能引起金黄色葡萄球菌食物中毒症状[4]；而单核增生李斯特氏菌广泛存在于土壤、人和动物的粪便中，容易污染食品，引起食物中毒的致病因子为李氏溶血素和内化素[5]。有报道显示，金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌等致病菌在奶类、肉类、鲜切蔬菜等产品中均有不同程度的检出[6-10]。而现制现售类食品由于涉及原料种类繁多，制作过程、销售形式和食用方式具有多样性，因此对微生物的控制则显得更加重要。传统的微生物检测方法大都需要经过增菌、分离、纯化和鉴定等步骤，过程繁琐，耗时较长，对现制现售类食品的微生物情况不能作出迅速反应。因此，开展致病菌快速检测方法的研究，是食品安全检测的一个重要方向。

目前，针对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的检测方法多集中于聚合酶链式反应方法（polymerase chain reaction，PCR）[11-13]和实时荧光 PCR（realtime polymerase chain reaction，RT-PCR）的检测方法[14-16]，而利用PCR 技术结合高分辨率熔解曲线（high-resolution melting curve，HRM）的多重检测报道则较少。因此，本试验以现制现售的果蔬饮料为样本，采用实时荧光PCR 结合高分辨率熔解曲线分析方法，建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的多重方法体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验采用的菌株均采购自美国菌种保藏中心（american type conservation center，ATCC），如表 1 所示。

表1 菌株名称及编号Table 1 Name and number of the bacteria

1.1.2 主要试剂

缓冲蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）：北京陆桥技术股份有限公司；LightCycler 480 高分辨率熔解分析预混液：罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.1.3 引物

查阅标准，参考SN/T 1689-2007《食品中多种致病菌快速检测方法PCR 法》标准中列出的引物序列，见表2，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 主要仪器

LightCycler 480-Ⅱ荧光定量PCR 仪：罗氏诊断产品（上海）有限公司；MK-10 干式恒温器：杭州奥盛仪器有限公司；Legend Micro 21R 冷冻离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；XK96-A 快速混匀器：江苏新康医疗器械有限公司；NanoDrop OneC超微量分光光度计：赛默飞世尔科技公司；SPX-400-Ⅱ生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司。

表2 两种致病菌的引物序列Table 2 Primers of 2 pathogenic bacteria

1.2 试验方法

1.2.1 样本制作及DNA 模板提取

将目标菌人工接种于果蔬汁样本中，作为原始试验样本，并进行梯度稀释。36 ℃培养24 h，培养过程中每隔一定时间进行平板计数。培养完成后，吸取1 mL 样液到1.5 mL 灭菌离心管中，12 000 r/min 离心5 min，弃上清液；随后加入50 μL 灭菌蒸馏水，并用快速混匀器混匀，放入100 ℃干式恒温器中裂解10 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液于另一灭菌离心管中，该溶液即为DNA 提取液，同时测定DNA 模板浓度及纯度。吸取上清液时注意不要吸到底部沉淀物。

1.2.2 RT-PCR 体系的建立

根据LightCycler 480 High Resolution Melting Mas ter 试剂盒说明书，配置 20 μL 的 PCR 反应体系，其中包含 10 μL Master Mix（2×conc.），1μL 上游引物（4 μmol/L），1μL 下游引物 （4 μmol/L），2 μL MgCl2（25 mmol/L），5 μL DNA（样品以目标菌 DNA 为模板，对照以无菌去离子水为模板）。

反应程序为：95 ℃预变性10 min；以95 ℃变性10 s，58 ℃退火 15 s，72 ℃延生 15 s，扩增 40 个循环。PCR 产物随后进行高分辨率熔解曲线分析，熔解程序为：95 ℃ 1min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s；然后升温至 95 ℃（此时熔解速率为0.01 ℃/s），最后40 ℃冷却。

1.2.3 RT-PCR 反应特异性

在RT-PCR 反应体系建立的基础上，混合表1 所示的5 种常见致病菌的DNA 模板，分别对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌进行了特异性试验。

2 结果与讨论

2.1 样本的培养及DNA模板测定

人工接种两种目标菌的样本在BPW 培养液中培养，按 10 倍梯度稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的培养液，分别在 0、3、6 、24 h 进行平板计数，选取原始试验样本在0 h 时平板计数结果数量级为102的样本进行统计，此时的金黄色葡萄球菌稀释梯度为10-5，单核增生李斯特氏菌的稀释梯度为10-6，结果见表3。

表3 样本中两种致病菌的平板计数Table 3 The content of 2 pathogenic bacteria in samples

由表3 可知，金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌在BPW 培养液中均能有效繁殖，且呈现相似的生长速率，因此试验采用的BPW 培养液能应用于实际样品。试验按1.2.1 方法对制作的原始样本液进行DNA 提取，并测定其浓度及纯度。检测结果显示，含金黄色葡萄球菌样本的DNA 浓度为12.3 μg/mL，纯度范围为1.67～1.86，含单核增生李斯特氏菌的DNA 浓度为 19.7 μg/mL，纯度范围为 1.75～1.82，均能满足 PCR试验要求。

2.2 RT-PCR方法的建立

在RT-PCR 反应时，由于引物长度不同、碱基不同，因此退火温度对两种菌的检测影响较大。针对以上两种目标菌的退火温度，在55 ℃～60 ℃范围内进行预试验。结果表明，在55 ℃～59 ℃金黄色葡萄球菌能有效扩增，58 ℃～59 ℃时单核增生李斯特氏菌能有效扩增，且非特异性扩增均不明显。虽然单重试验时，退火温度在58 ℃和59 ℃时两种菌均能扩增，但结合熔解曲线分析，发现58 ℃时扩增效果更好，因此建立方法时选取58 ℃作为退火温度，DNA 浓度稀释10 倍时的结果见图1、图2。

图1 DNA 浓度稀释10 倍时金黄色葡萄球菌熔解曲线峰Fig.1 The HRM peak of Staphylococcus aureus at the DNA concentration of 10-1

图2 DNA 浓度稀释10 倍时单核增生李斯特氏菌熔解曲线峰Fig.2 The HRM peak of Listeria monocytogenes at the DNA concentration of 10-1

把2.1 制备的两种目标菌的DNA 溶液进行梯度稀释，分别稀释至原来浓度的 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，按建立的方法进行扩增，并计算两种目标菌的平均Tm 值，结果显示金黄色葡萄球菌的Tm 值为77.05 ℃，最大偏差为0.51 ℃；单核增生李斯特氏菌的Tm 值为79.39 ℃，最大偏差为 0.46 ℃。由图1、图 2 可见，两种目标菌的熔解曲线峰型均较好，且无非特异性熔解峰，因此退火温度选取58 ℃时，该方法针对两种致病菌能进行有效地定性分析。

2.3 双重RT-PCR试验

试验在做双重反应时，将两种目标菌的原始DNA提取液经适度稀释后，按等比例混合，制成混合模板，然后将混合模板按10 倍比例梯度稀释。PCR 反应体系中同时加入两种目标菌的引物及DNA 混合模板，按1.2.2 配制反应体系，不足20 μL 用无菌去离子水补足。然后按2.2 方法条件进行双重试验，PCR 扩增曲线结果见图3。

图3 双重试验的扩增曲线Fig.3 The RT-PCR curve of duplex reaction

在双重试验中，也比较了58 ℃和59 ℃两种退火温度。结果发现，退火温度为59 ℃时，单核增生李斯特氏菌扩增较好，且熔解曲线峰明显，但金黄色葡萄球菌扩增效果不理想，熔解曲线峰型较小，与单核增生李斯特氏菌区分不明显，存在交叉区域；而当退火温度设置为58 ℃时，两者均得到有效扩增，且熔解曲线峰能彻底分开。

双重试验的高分辨率熔解曲线图见图4、图5。

图4 双重试验的高分辨率熔解曲线图Fig.4 The HRM of duplex reaction

图5 双重试验的熔解曲线峰Fig.5 The HRM peaks of duplex reaction

由此推测，在双重试验时两种目标菌的扩增存在竞争，不同退火温度下竞争效果不同，试验结果显示，退火温度设置为58 ℃时，混合体系能实现最优扩增。

由图3～图5 可知，退火温度设置为58 ℃时双重试验效果较为理想，金黄色葡萄球菌的Tm 值范围为76.72 ℃～76.90 ℃，单核增生李斯特氏菌的Tm 值范围为 79.54 ℃～79.85 ℃，与 2.1 结果相符，均在偏差范围内。因此，试验建立的双重试验方法，扩增时退火温度选择58 ℃，能同时对两种目标菌进行定性分析。此时，金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的检测灵敏度分别达到 2.29×10-3、2.08×10-2μg/mL；按平板计数结果计算，金黄色葡萄球菌检测灵敏度达到102CFU/g，单核增生李斯特氏菌的检测灵敏度达到103CFU/g。

试验中还发现，在双重反应中利用高分辨率熔解曲线进行分析时，采用高饱和染料比SYBR GREEN 效果好，荧光信号采集更为灵敏；另外，熔解速率对试验影响也较大，温度分辨率越高越好，本试验在设定熔解速率为0.01 ℃/s 时，2 种目标菌的熔解曲线峰彻底分开。

2.4 RT-PCR反应体系中引物的特异性

在特异性反应试验时，混合表1 中5 种致病菌的DNA 模板，分别对2 组引物进行特异性试验，结果见图6。

图6 2 种致病菌的高分辨率熔解曲线峰Fig.6 The HRM peaks of 2 pathogenic bacteria

由图6 可知，两种目标菌均能很好地扩增，未受其他菌的干扰，金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特氏菌的Tm 值分别为76.67、79.68 ℃，与2.2 试验中偏差范围相符。由此可见，该反应体系中2 种目标菌的引物均具有较好的特异性。

3 结论

本试验建立了RT-PCR 结合高分辨率熔解曲线对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的双重检测方法。试验通过对退火温度的比较，确定双重试验的退火温度为58 ℃，这时的检测灵敏度分别可以达到金黄色葡萄球菌102CFU/g，单核增生李斯特氏菌103CFU/g。两种目标菌的Tm 值分别为金黄色葡萄球菌77.05 ℃，单核增生李斯特氏菌79.39 ℃。试验采用直接提取法提取样品中的DNA，其操作简单，提取时间短，DNA 纯度范围均在1.6～1.9 之间，能满足PCR 检测要求。通过双重检测方法体系的建立，针对以上两种致病菌，检验过程简单方便，与常规微生物检测方法比较，大大提高了检测时效性，且该方法的灵敏度、特异性均满足要求，为实现餐饮食品中微生物的快速筛选提供参考。

通过试验发现，反应体系建立时，退火温度至关重要，根据目标菌的特性适当调整退火温度，使得在相同退火温度等PCR 参数条件下实现多重检测的目的。另外，在做高分辨率熔解曲线时，采用高饱和染料在多重试验中有更好的应用，且试验条件中熔解速率较为关键，本试验经比较，最终确定熔解速率为0.01 ℃/s，在该条件下，荧光信号采集较为灵敏，能很好地利用高分辨率熔解曲线进行定性分析。由此可知，在做高分辨率曲线时，高饱和染料、温度分辨率等条件是影响试验结果的主要因素。