槟榔中苯并（α）芘检测方法研究
2020-02-29吴海智周丛冉丹达丽君
吴海智，周丛，冉丹，达丽君
（湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南长沙410007）
苯并（α）芘是一种强致癌物，是多环芳烃类中毒性最大的一种，其毒性超过黄曲霉毒素，对动物和人均具有致癌作用[1-2]。槟榔一般采用烟熏烘烤加工[3]，而熏烤过程中由于木炭、煤炭等燃烧不完全容易产生苯并（α）芘，从而污染食品[4]。GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》以及槟榔两大生产省份海南省食用槟榔地方标准DB 46/T 75-2007《食用槟榔》、湖南省食用槟榔地方标准DB 43/132-2004《食用槟榔》均未对槟榔中苯并（α）芘含量做出限量要求，以致槟榔中苯并（α）芘含量属于无人监管监测的状态，存在食品安全隐患。
现行的苯并（α）芘的测定标准GB 5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（α）芘的测定》，适用范围不包括槟榔，且国家标准方法存在操作时间较长、测试成本较高和回收率不稳定等问题。而目前对槟榔中苯并（α）芘检测方法的研究主要集中在气-质联用法或液质法[5-7]，这些方法对仪器要求较高，难以普及。因此开展对槟榔中苯并（α）芘检测方法研究，寻求一种准确、快速、简便的检测方法具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
1.1.1 仪器
LC-30A 型超高效液相色谱仪（包括四元汞、脱气机、自动进样器、柱温箱、化学工作站、荧光检测器）：日本岛津公司；GM200 刀式研磨仪：德国莱驰公司；SI-234 电子天平：美国丹佛仪器公司；Allegra 25R 高速离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；YQ-1007A 超声波清洗器：上海易净超声波仪器有限公司。
1.1.2 试剂材料
Diamon sil C18 柱、中性氧化铝柱Dikma：迪马科技有限公司；分子印迹柱CNW Ploy-sery MIP-Bap：上海安谱科学仪器有限公司；乙腈（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、二氯甲烷（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；苯并（α）芘标准品（纯度≥98.8%）：Dr.Ehrenstorfer公司。
槟榔烟熏原果：湖南省产商品质量监督检验研究院提供；槟榔成品：长沙各槟榔经销店。
1.1.3 标准溶液配制
精确称取 10 mg 苯并（α）芘于 100 mL 容量瓶中，用少量甲苯溶解后，用乙腈溶解定容，配制成0.1 mg/mL的储备液。吸取储备液1 mL，用乙腈定容至100 mL，配制成1 000 ng/mL 的中间液，再分别吸取一定量的中间液用乙腈稀释成 1、5、10、20、50、100 ng/mL 的标准工作溶液，液相色谱仪进行测定分析，以标准系列工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。
1.2 试验方法
1.2.1 样品前处理优化
对样品的前处理方法中超声辅助提取时间、提取次数进行了选择，并对样品的净化方法进行了比较研究，重点比较了未净化和经GB 5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（α）芘的测定》规定的两种净化方法对样品的净化效果。
1.2.2 样品的前处理
将样品去除辅料，用刀式研磨仪将槟榔制备成蓬松形状，用于样品分析。准确称取0.5 g 左右的样品于50 mL 具塞离心管，加入15 mL 正己烷，超声提取10 min后，5 000 r/min 离心5 min，转移出上清液，并用少量正己烷润洗残渣，与上清液合并于40 ℃氮吹浓缩至干，用1 mL 乙腈涡旋复溶0.5 min，过0.45 μm 有机滤膜后按照选定的色谱条件进样分析。
1.2.3 色谱条件
Diamon sil C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）反相色谱柱；荧光检测器检测：激发波长384 nm，发射波长406 nm；柱温 35 ℃，进样量 10 μL；流动相：乙腈 ∶水=88 ∶12，流速 1.0 mL/min。
2 结果与讨论
2.1 超声辅助提取时间的选择
超声辅助提取时间对检测结果的影响见图1。
图1 超声辅助提取时间的选择Fig.1 The selection of ultrasound-assisted extraction time
从图1 可以看出，超声时间＜10 min 时，检测值随超声时间的增加而升高，当超声时间为10 min 时，样品检测值不再升高，提取效率达到最大。
2.2 超声辅助提取次数的选择
提取次数对检测结果的影响见图2。
图2 超声辅助提取次数的选择Fig.2 The selection of ultrasound-assisted extraction number
从图 2 可以看出，样品苯并（α）芘检测值在5 μg/kg～40 μg/kg 范围内，超声辅助提取1 次和提取2 次的检测结果基本保持一致，超声辅助提取次数对结果影响很小。
2.3 净化方法的选择
未净化和经GB 5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（α）芘的测定》规定的两种净化方法净化后的槟榔烟熏原果色谱对照图见图3。
从图3 可以看出，未净化的样品色谱图杂峰相对较多、较高，但在苯并（α）芘出峰附近无明显干扰峰，分离定性定量效果良好；经分子印迹柱净化后样品色谱图，谱图杂峰会减少，但是杂峰依旧很多，且过柱操作的时间和经济成本较高；经中性氧化铝柱净化后杂峰会明显减少很多，但是中性氧化铝柱存在回收率不稳定以及柱容量有限等问题，故本研究选择对样品不进行净化操作。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线及线性方程
图3 色谱对照图Fig.3 Chromatogram comparison
将标准工作溶液依次经液相色谱仪测试分析，以标准系列工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作图得苯并（α）芘的线性方程及相关系数见表1。
表1 线性方程及相关系数Table 1 The linear equation and correlation coefficient
2.4.2 精密度、回收率
在未检出苯并（α）芘的槟榔样品中进行3 个水平（0.5、5、20 μg/kg）、6 个平行的加标回收试验，测定后得到苯并（α）芘的加标回收率和相对标准偏差。在本试验条件下，3 个添加水平下苯并（α）芘的平均回收率为97.5%～102%，相对标准偏差为3.11%～4.64%，结果见表2。
表2 加标回收率试验结果（n=6）Table 2 Results of recovery rate（n=6）
根据GB/T 27404-2008《试验室质量控制规范》规定，添加水平在＜0.1 mg/kg，回收率范围应在60 %～120%，变异系数＜15%，方法加标检测结果满足规范要求。
2.4.3 准确度
本方法与GB 5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并（α）芘的测定》方法比对结果见表3。
表3 方法比对结果Table 3 The results of method comparison
结果显示，不同方法的测试结果的绝对差值均小于算术平均值的5%，表明本方法具有较高的准确度。
2.4.4 方法检出限、定量限
在0.5 g 未检出苯并（α）芘槟榔样品中加入0.25 ng苯并（α）芘对照品，以基线10 倍噪声值为定量限在标准曲线查得结果计算[8]，测得方法检出限为0.5 μg/kg。
2.5 实际样品检测
对42 批次的槟榔烟熏原果、21 批次市售槟榔成品的苯并（α）芘含量进行测定，测定结果分别见表4、表5。
表4 槟榔烟熏原果测定结果Table 4 Test results of areca nut smoked fruits
续表4 槟榔烟熏原果测定结果Continue table 4 Test results of areca nut smoked fruits
表5 槟榔成品测定结果Table 5 Test results of areca nut products
由表4 可见，槟榔烟熏原果的苯并（α）芘检出率高达95.2%，最高检测值为45.2μg/kg。由表5 可见，市售槟榔成品中苯并（α）芘检出率为76.2%，最高含量为21.4 μg/kg。无论是槟榔烟熏原果还是市售槟榔成品苯并（α）芘检出率和检出值都较高，以GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》对植物油苯并（α）芘限量要求≤10 μg/kg 为判定要求，烟熏原果问题检出率为73.8%，市售的食用槟榔成品问题检出率为23.8%。以日本及国际标准对一般食品限量要求≤5 μg/kg 为判定要求，则烟熏原果问题检出率高达90.5%，市售的槟榔问题检出率也达到了33.3%。
3 结论
本文对槟榔中苯并（α）芘检测方法进行了研究，建立了槟榔中苯并（α）芘残留的高效液相色谱快速测定法。试验结果表明，方法加标回收率为97.5%～102%，相对标准偏差为3.11%～4.64%，线性相关系数R=0.999 99，定量限为0.5 μg/kg。该法样品前处理简单，试剂消耗少，分析时间短，准确性和精密度好，适用于槟榔中苯并（α）芘的定性定量检测。同时本研究还对槟榔烟熏原果和市售槟榔成品的苯并（α）芘含量进行了测定，测定结果显示，烟熏原果问题检出率高达90.5%，市售的槟榔问题检出率也达到了33.3%。
