饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测方法的改良

章海通，承海，邢家溧，，*，王绍辉，周霞霞，徐晓蓉，严小军

（1.宁波市食品检验检测研究院，浙江宁波315048；2.宁波大学海洋学院，浙江宁波315211；3.宁波大学食品与药学学院，浙江宁波315211）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）因能分解肌肉和结缔组织中的糖类产生大量气体并在体内形成荚膜而得名[1]，该菌是后壁菌门梭状芽胞杆菌属的一种，呈粗短的大杆状，无鞭毛，专性厌氧的革兰氏阳性菌[2]。多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、动物及其肠道中，是肠道的正常菌群之一，同时也是一种条件致病菌[3-4]。

产气荚膜梭菌在GB 8537-2018《食品安全国家标准饮用天然矿泉水》[5]标准中对其要求为从一批样品中采集5 件样品，每件样品的采样量50 mL，均不得检出。检验方法按GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》[6]将矿泉水过滤后的滤膜紧贴在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（sulfitepolymyxin-sulphadiazine agar，SPS） 上 36 ℃厌氧培养24 h，计数滤膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做进一步的验证试验。但实际检验过程中发现完全按照GB 8538-2016 方法检验，滤膜上截留的产气荚膜梭菌在SPS 培养基上36 ℃厌氧培养24 h，并无明显的黑色菌落，在此情况下容易误认为被检样品中不含产气荚膜梭菌，而导致漏检。为此，本文对国标法进行改良，并对适用的培养基进行优选，以使检测结果更加准确可靠。

1 材料与方法

1.1 菌株

产气荚膜梭菌CICC22949：中国工业微生物菌种保藏中心，-70 ℃磁珠保藏。

1.2 主要培养基和试剂

亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶琼脂、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（tryptose-sulfite-cycloserine agar，TSC）、液体硫乙醇酸盐培养基（thioglycollate medium，FTG）、动力-硝酸盐培养基、缓冲动力-硝酸盐培养基、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、血平板、革兰氏染色液：北京陆桥技术股份有限责任公司；孔径为0.22 μm的无菌滤膜：广东环凯微生物科技有限公司；饮用矿泉水：华润万家超市。

1.3 主要仪器

1378 二级生物安全柜：美国Thermo Fisher 公司；IF750 恒温培养箱：德国 memmert 公司；Anaer obox IV多组分气体培养系统：中国江雪公司；illiflex RLUS Pump 微生物过滤系统：美国Millipore 公司。

1.4 方法

1.4.1 菌悬液的制备

将保藏于磁珠中的标准储备菌株接种于血平板上并置于36 ℃培养箱中厌氧培养，待血平板上长出明显菌落，再挑取上述血平板上的单菌落接种于FTG 培养基并于36 ℃厌氧培养24 h，用0.85%的无菌生理盐水连续梯度稀释培养后的FTG 培养基，控制菌浓度在10 CFU/mL～102CFU/mL，无菌吸取1 mL 稀释后的菌液加入到50 mL 无菌矿泉水中作为人工污染样品。

1.4.2 国标方法检测

按照国标方法GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》，取50 mL 用产气荚膜梭菌CICC22949 人工污染的水样经孔径为0.22 μm 的无菌滤膜过滤，将滤膜移至SPS 培养基上，于36 ℃厌氧培养24 h，观察结果。

1.4.3 改良方法1——双层培养基覆盖法

水样过滤同1.4.2 方法，将滤膜紧贴于SPS 培养基上后，先覆盖一层（约10 mL）SPS 培养基，待其凝固后再加盖一层（约5 mL）SPS 培养基，待培养基凝固后于36 ℃厌氧培养24 h，观察结果。

1.4.4 改良方法2——培养基优选

采用双层培养基改良法，分别选择低浓度、中浓度、高浓度标准菌株菌悬液，应用SPS 培养基和TSC培养基对人工污染水样进行检测，各自计数黑色菌落，对定量检测结果进行分析比对。同时取无菌矿泉水，采用双层培养基覆盖改良法检测作为空白对照。

1.4.5 确证试验

将可疑菌落接种于FTG 36 ℃培养基厌氧培养24 h，参照国标法分别做革兰氏染色镜检、硝酸盐还原试验、牛奶发酵试验、卵磷脂分解试验。

2 结果与分析

2.1 国标法和改良法1的试验结果对比

改良方法1 和国标方法检测矿泉水中产气荚膜梭菌在SPS 培养基上的菌落特征见图1。

图1 产气荚膜梭菌在SPS 培养基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of Clostridium perfringens on SPS medium

由图1 可知，国标法滤膜上的菌落无黑色，采用双层培养基覆盖改良方法1 滤膜上有典型的黑色菌落，效果明显。产气荚膜梭菌在厌氧条件下能把TSC 和SPS 培养基中的亚硫酸盐还原为硫化物，再与柠檬酸铁铵反应产生硫化铁而使菌落呈黑色[7]。除产气荚膜梭菌外，其它的梭状芽孢杆菌则被添加的抗生素所抑制[8]，因此滤膜上的黑色菌落具有一定的特征性[9]。产气荚膜梭菌在培养基上生长过程中，硫化物的产生和铁离子的直接接触是菌落呈现黑色的关键因素[10]。由此推测，国标法因为滤膜的阻隔使细菌不能直接接触到培养基中的铁离子，从而不能产生黑色的硫化铁，故菌落不呈黑色。在滤膜上加盖一层培养基后，目标菌能和培养基充分接触，因此能有效的避免上述情况，使平板上出现明显的黑色菌落。当滤膜上的目标菌较多的时候，覆盖第一层培养基的过程中可能会把部分滤膜上的产气荚膜梭菌带到培养基表面，使菌落不显黑色或者黑色不明显而影响计数结果。当其凝固后滤膜上的产气荚膜梭菌已固定在培养基里面或者表面，最后再加盖一层培养基，这样可以让所有的产气荚膜梭菌都完全在培养基里面，经36 ℃厌氧培养后都能显示明显的黑色。

2.2 不同培养基的检测结果比较

产气荚膜梭菌在两种培养基上的生长计数结果见表1 和图2。

表1 产气荚膜梭菌在两种培养基上的计数结果（，n=5）Table 1 Enumeration results of Clostridium perfringens on two media（，n=5）

表1 产气荚膜梭菌在两种培养基上的计数结果（，n=5）Table 1 Enumeration results of Clostridium perfringens on two media（，n=5）

菌浓度选择 SPS 上黑色菌落数 SPS 空白 TSC 上黑色菌落数 TSC 空白低浓度 4±1 0 8±1 0中浓度 17±1 0 37±1 0高浓度 68±3 0 132±5 0

图2 产气荚膜梭菌在TSC 和SPS 两种培养基上的生长计数结果Fig.2 Growth counting results of Clostridium perfringens on two media of TSC and SPS

目前检测产气荚膜梭菌的选择性培养基主要是TSC 和SPS，其中以TSC 最为常用，该培养基亦是美国分析化学家协会推荐用于分离产气英膜梭菌的选择性培养基[11]。采用双层培养基覆盖改良方法，产气荚膜梭菌标准菌在TSC 平板和SPS 平板上均可形成典型的黑色菌落。同一水样滤膜在TSC 平板上所形成的典型黑色菌落计数值高于SPS 平板上计数值，两者间存在显著性差异（P＜0.05）。由此推测，相比于SPS 培养基TSC 培养基更适合产气荚膜梭菌的生长。图2 为产气荚膜梭菌在TSC 和SPS 两种培养基上的生长计数情况。为了提高矿泉水中产气荚膜梭菌的检出率，防止漏检，建议使用TSC 培养基作为计数用的选择性培养基。综合两种改良方法，我们认为矿泉水中产气荚膜梭菌的检测方法可优化为TSC 培养基代替SPS 培养基，再用双层培养基加以覆盖，能使试验现象更加明显，计数效果更好，提高检出率，尽量避免因方法原因带来的漏检。

2.3 确证试验结果

按照国标方法，挑取滤膜上单个黑色可疑菌进行确证试验，结果见表2、图3～图5。

表2 产气荚膜梭菌确证试验结果及现象Table 2 Confirmatory test results and phenomena of Clostridium perfringens

图3 产气荚膜梭菌染色镜检和卵磷脂分解试验结果Fig.3 Results of microscopic examination and lecithin decomposition test of Clostridium perfringens

图4 动力硝酸盐试验结果Fig.4 Dynamic nitrate test results

图5 产气荚膜梭菌牛奶分解试验结果Fig.5 Results of milk decomposition test of Clostridium perfringens

镜检可见该菌为革兰氏阳性粗大杆菌，偶见芽孢，硝酸盐还原试验、卵磷脂分解试验和牛奶发酵试验均为阳性。产气荚膜梭菌能产卵磷脂酶分解卵黄平板中的卵磷脂，因此点种点周围会出现乳白色的浑浊带；且此菌无动力，穿刺线不呈扩散生长，能还原硝酸盐，培养基变红色；产气荚膜梭菌会发酵乳糖，凝固酪蛋白，呈“爆裂发酵”现象，培养基不变黑。此外，试验结果发现，与动力硝酸盐培养基相比，采用缓冲动力硝酸盐培养基进行硝酸盐还原试验，显色反应更快速，色差显示更明显。

3 讨论

在实际工作中积累的一些经验也有利于对检测方法的准确掌握和运用。首先，当样品污染程度较高的时候，取样过滤时，为了获得较好的计数效果，可将原液进行适当的稀释。尽量使用新鲜配制的培养基，如果培养基在空气中长时间暴露，表面的氧化还原电势下降，会影响厌氧菌的生长发育，相关文献也有类似的报道[12]。其次，TSC 培养基并非能抑制其他所有的杂菌，挑取可疑的黑色菌落接种至FTG 培养基培养后，若镜检发现培养液不纯，则需将黑色菌落划线至TSC 分离纯化[13]，再挑取单个典型的黑色菌落接种至FTG 培养基，用于后续的确证试验。最后，在确证试验过程中，“爆裂发酵”现象与含铁牛奶培养基的配制方式有一定的相关性，经高温高压灭菌的培养基的试验效果没有煮沸灭菌法配制的含铁牛奶培养基效果佳，这可能是由于在高温高压下部分牛奶会出现变性而影响牛奶发酵试验的效果。分别采用动力硝酸盐培养基和缓冲动力硝酸盐培养基进行硝酸盐还原试验，结果发现无论是颜色的辨识度还是显色速度都是缓冲动力硝酸盐培养基优于动力硝酸盐培养基，因此建议用缓冲动力硝酸盐培养基代替动力硝酸盐培养基做硝酸盐还原试验。

本文从检测方法完善和培养基优选两方面对矿泉水中产气荚膜梭菌滤膜检测国标法进行改良，用新鲜配制的TSC 培养基经双层培养基覆盖改良后的方法检测产气荚膜梭菌，现象更明显，结果更可靠，更适合饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌的检验。提高了饮用矿泉水中产气荚膜梭菌检测的准确性。随着检测技术的不断发展，微生物的鉴定手段更加多样，有条件的实验室也可以同步采用全自动微生物鉴定系统、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术或聚合酶链式反应方法进行鉴定[14-16]，结合对传统检测方法的改进，必将进一步提高产气荚膜梭菌鉴定结果的高效性和准确性。