均匀设计法优化丁香精油提取工艺及其抑菌活性研究

张学彬，谷东建，刘增博，张学礼，高丹，张华博

（1.北京交通大学海滨学院化学工程系，河北沧州061199；2.黄骅市易简科技有限公司，河北沧州061100）

丁香为桃金娘科植物，花序硕大、开花茂盛、花色淡雅、芳香习性强健，栽培简易，因而在园林中广泛栽培应用，为药食两用植物。干燥的丁香花蕾具有极高药用价值，形状呈短棒状，长1.2 cm～2 cm，色棕紫；下部为圆柱状略偏的萼管，上部近圆球形。香气浓烈味辛、性温，油性足。药理具有温中降逆、温肾助阳、抑菌驱虫、芳香健胃、抗病毒等作用[1-3]。在生活中丁香精油不仅是食品、香烟等调配料，还是高级化妆品的主要原料，又是牙科药物中不可缺少的防腐镇痛剂。其中的丁香酚、β-石竹烯以及乙酰基丁香酚为丁香精油主要成分[4]，因此丁香精油的分离与提纯工艺得到人们肯定与研究。

目前，丁香精油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法、超临界CO2流体萃取法[5-9]。其中有机溶剂萃取法，是根据有机溶剂与丁香精油相似相溶原理，利用其对丁香精油的高选择性完成对丁香精油的萃取，并且最大程度的保持了丁香精油的成分和香气。由于在丁香精油提取分离中影响因素较多，所以导致试验次数巨大且丁香精油收率较低[10-12]，目前还存在最优工艺方法选取难度大等问题。

新鲜果蔬采后被病原生物侵染严重问题[12-16]。目前控制果蔬采后病害的最有效手段是化学杀菌剂与冷藏结合处理，但由于化学杀菌剂残留危害人类健康及植物病原菌对化学杀菌剂产生抗药性等诸多问题的存在，寻找筛选有效的果蔬保鲜方法有极大前景。研究表明植物提取物中含有抑制病原微生物的成分[16-20]，其中从食用中药和香辛料中提取天然防腐保鲜剂，被认为是食品添加剂研究领域中非常有前景的发展方向，是开发新型高效果蔬生物防腐保鲜剂的重要途径[21-27]。

本文采用均匀设计法优化有机溶剂萃取丁香精油工艺。以丁香精油的收率为目标，考察萃取温度、原料颗粒度、溶剂种类、料液比对丁香精油收率的影响，选取最优工艺条件，回归分离萃取模型，并验证，为丁香精油的分离与提纯工艺选择提供基础。同时进行丁香精油对果蔬采后病原菌的抑制效果研究[28]，为开发果蔬采后天然防腐保鲜剂提供基础，对其在食品防腐保鲜中的应用具有重要的社会意义和学术价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

GC126A：上海仪电分析仪器有限公司；DC-0510恒温循环水浴：艾普仪器有限公司；JJ-2 组织捣碎机：上海汗诺仪器有限公司；BSM220.4 电子分析天平：上海卓精电子科技有限公司；RE-52 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）系列循环水式真空泵：浙江力辰仪器科技有限公司；GMSX-280 灭菌锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；303-00A 生化培养箱：上海坤天实验仪器有限公司；850SW-CJ-1D 超净工作台：上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 材料与试剂

丁香花蕾：苏州市天灵中药饮片有限公司；无水乙醇（分析纯）、无水乙醚（分析纯）、丙酮（分析纯）、石油醚（分析纯 90 ℃～120 ℃）、正己烷（分析纯）、冰醋酸（分析纯）：天津市致远化工试剂有限公司；丁香酚、乙酰基丁香酚：Sigma 公司；琼脂粉（生化试剂）、葡萄糖（分析纯）：天津市化学试剂厂。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

将丁香花蕾筛检、除杂、洗净后，置于烘干箱中45 ℃烘干24 h，选取适量样品加入捣碎机粉碎，用电动筛分机筛分，选取50 目～150 目备用。

取10 g 的丁香花蕾粉置于索氏提取器中，选用不同萃取试剂并且控制料液比，设置一定温度、压力和充分萃取时间，进行3 次虹吸萃取丁香精油。

将含有丁香精油的有机溶剂转移至旋转蒸发器中进行旋转蒸发，分离有机溶剂，得到产物丁香精油。丁香精油收率：

式中：m 为丁香精油质量，g；n 为丁香花蕾质量，g。

1.3.2 气相色谱分析与检测

气相色谱条件，进样温度：250 ℃；升温程序：50 ℃开始以6 ℃/min 的速度升温至110 ℃，稳定5 min；而后以5 ℃/min 的速度升温至160 ℃，稳定5 min；再以4 ℃/min 的速度升温至 200 ℃，稳定 5 min；最后以5 ℃/min 的速度升温至 250 ℃。

1.3.3 病原菌提取与鉴定

采用柯赫氏法则选取分离青霉菌和浆胞。选取腐烂冬枣，用酒精进行表面消毒，切取腐烂组织1 cm2移入培养基，25 ℃培养72 h，将新生菌落的少量菌丝移入新培养基培养，重复操作3 次～5 次，获得纯化菌种[15]。

1.3.4 药品溶液制备

1.3.4.1 精油制备

将原油用丙酮溶解并用蒸馏水稀释成0.25、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL/mL 的溶液。

1.3.4.2 菌种孢子悬浮液制备

用1%无菌葡萄糖溶液溶解菌种新生孢子，充分搅拌，过滤，将滤液充分摇匀，在显微镜下调节其浓度至每个视野中包含50 个孢子。

1.3.5 抑菌试验方法

取25 μL 各浓度精油液体于凹玻片中，清水为空白对照，加入100 μL 孢子悬浮液，将凹玻片置于25 ℃PDA 培养基的培养箱，培养12 h，统计孢子萌发情况，计算萌发率和抑制率[28]。

萌发率/%=（萌发孢子数/孢子数）×100

抑制率/%=（对照组萌发率-处理组萌发率）/对照组萌发率×100

1.4 设计试验

1.4.1 单因素试验

研究萃取温度、原料颗粒度、溶剂种类、料液比等因素对丁香精油收率的影响，筛选影响丁香精油收率的较优值，着重筛选最优萃取溶剂。

1.4.2 U6（64）均匀设计法

采用均匀设计法，筛选出影响丁香精油收率的因素（萃取温度、原料颗粒度、溶剂种类、料液比）的优值。以优化有机溶剂萃取丁香精油工艺。均匀设计法试验设计见表1。

表1 有机溶剂萃取丁香精油工艺均匀设计试验U6（64）水平表Table 1 Organic solvent extraction and extraction of lilac essential oil process uniform design test U6（64）level

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 溶剂种类对丁香精油收率的影响

表2 和图1 为采用萃取温度为80 ℃、丁香花蕾颗粒度110 目、料液比为1 ∶15（g/mL）条件下溶剂种类对丁香精油收率的影响。

表2 溶剂种类对丁香精油收率的影响Table 2 Effects of solvents on the yield of clove essential oil

图1 溶剂种类对丁香精油收率的影响Fig.1 Effect of solvent type on yield of clove essential oil

溶剂种类不同，精油收率存在明显差异，精油质量也有较大不同[19]。其中只有在正己烷的条件下，萃取的丁香精油品质最好，丁香精油呈现澄清的金黄色，流动性好，具有丁香芬芳气息。冰醋酸验证在弱酸环境中在一定程度上破坏了精油品质，无水乙醇、无水乙醚、丙酮均存在不同程度的杂质，这是由于丁香中的一些蜡、油脂、胶质、树脂等成分在回流中溶解在有机溶剂中，石油醚提取的精油品质稍逊与正己烷，精油呈现淡绿色。从溶剂极性看（乙酸＞乙醇＞乙醚＞丙酮＞石油醚＞正己烷）而丁香酚、β-石竹烯和乙酰基丁香酚均属于弱极性或非极性物质，因此正己烷可以作为最优萃取溶剂。

2.1.2 萃取温度对丁香精油收率的影响

图2 为采用正己烷作为有机溶剂、料液比 1∶15（g/mL）、丁香花蕾颗粒度110 目条件下萃取温度对丁香精油收率的影响。

图2 萃取温度对丁香精油收率的影响Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of clove essential oil

图2 中表明在一定条件下精油收率随温度的提高不断增加，但到达一定温度下精油收率出现下降。主要是随温度的提高，溶剂回流速率不断增加，回流时间降低，大大缩短了精油氧化过程。当温度过高时不仅破坏精油结构，同时加快了精油氧化速率，不仅造成精油收率下降，同时严重影响精油品质。

2.1.3 原料颗粒度对丁香精油收率的影响

图3 为采用萃取温度为80 ℃、正己烷为有机溶剂、料液比为1 ∶15（g/mL）条件下原料颗粒度对丁香精油收率的影响。

图3 颗粒度对丁香精油收率的影响Fig.3 Effect of particle size on yield of clove essential oil

由图3 可知，丁香花蕾在110 目时精油收率最大，为23.59%。随着颗粒度的增加，提高了原料与有机溶剂的接触面积，增加了传质速率，提高精油收率。当颗粒度继续增加时，表面张力增大，精油收率略有下降。

2.1.4 料液比对丁香精油收率的影响

图4 为采用萃取温度为80 ℃、丁香花蕾颗粒度110 目、正己烷为有机溶剂条件下料液比对丁香精油收率的影响。

图4 料液比对丁香精油收率的影响Fig.4 Effect of material liquid ratio on yield of clove essential oil

由图4 可知，随着溶剂体积的增加，提高了精油中酚类物质的溶解，即提高了精油中有效成分的含量。但随着溶剂体积的不断增加，溶剂回流时间不断提到，造成丁香精油的部分氧化，因此破坏了精油品质，降低了精油收率。

2.2 均匀设计法试验结果分析

利用均匀设计法进行有机溶剂萃取丁香精油试验，丁香精油的收率结果如表3 所示。采用Excel 软件对试验结果进行分析，得到回归结果。

表3 有机溶剂萃取萃取丁香精油工艺U6（64）均匀设计试验的丁香精油收率Table 3 Extraction and extraction of lilac essential oil by organic solvent extraction，the yield of lilac essential oil in the uniform design test of U6（64）

2.2.1 U6（64）试验回归

线性回归结果如表4～表7 所示。

线性相关系数R=0.955 42，测定系数R2=0.912 828，F=6.981 013＞显著水平临界值F，线性可信；由表6 可以得知，线性回归方程为：Y=0.284 3-0.004 5 X1+0.001 7X2+2.420 6X4。

表4 回归统计Table 4 Regression statistics

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

表6 参数表Table 6 Parameter table

表7 残差分析表Table 7 Residual analysis table

根据线性回归方程可得，各影响因素系数为正时，精油收率Y 增加，反之，精油收率Y 减小。因此当因素X2（颗粒度）、因素X4（料液比）越大，因素X1（温度）越小，精油收率越高。由此可以看出有机溶剂萃取丁香精油较优工艺：有机溶剂选用正己烷、萃取温度：80 ℃、颗粒度 110 目、料液比 1 ∶15（g/mL）。较优工艺条件下丁香精油的理论收率为23.59%。

2.2.2 验证试验

有机溶剂选用正己烷、萃取温度80 ℃、颗粒度110 目、料液比 1 ∶15（g/mL）的优工艺条件下丁香精油的收率为22.98%。所得精油品质好，呈棕黄色，清澈透明，含有浓郁丁香芬芳。主要活性成分含量：丁香酚13.27%、β-石竹烯1.26%和乙酰基丁香酚1.15%。

2.3 抑菌试验

将分离青霉病原菌菌种在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养 7 d，菌落呈白色粉末状，菌落铺展，直径70 mm，分生孢子顶端有瓶状物，分生孢子呈近圆形，大小约为（3～3.5）μm×（2.5～4.5）μm。鉴定为Penicillum spp，青霉菌属。

将分离浆胞病原菌在PDA 培养7 d，菌落呈浅灰色和棕褐色，菌落直径70 mm 有同心纹，分生孢子以孔生方式生长，呈褐色倒棒状，大小约为（22～41）μm×（5～15）μm。鉴定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目交链孢属。

2.3.1 丁香精油对致病菌孢子萌发抑制效果

丁香精油浓度为 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL/mL，对冬枣致病菌孢子萌发的抑制效果结果见表8。

表8 丁香精油对致病菌孢子萌发的抑制效果Table 8 Inhibitory effect of clove essential oil on pathogen germination

2.3.2 丁香精油抑制浓度

丁香精油最小抑菌浓度测定结果见表9。

表9 丁香精油最小抑菌浓度测定Table 9 Determination of minimum bacteriostatic and bactericidal concentration of clove essential oil

2.3.3 丁香精油抑菌效应活性成分确定

有机溶剂萃取出的丁香精油其成分为：丁香酚13.27%、β-石竹烯1.26%和乙酰基丁香酚1.15%。测定各个活性成分对青霉菌的抑制测定，结果见表10。

丁香酚和乙酰基丁香酚对青霉菌具有较强的抑制作用，350 mg/L 的丁香酚和300 mg/L 乙酰基丁香酚可完全抑制青霉菌的生长；乙酰丁香酚的抑菌活性大于丁香酚；β-石竹烯对青霉菌没有抑制效应。

表10 丁香精油主要成分对青霉菌的抑制效应Table 10 Inhibitory effect of main component oil on Penicillium

3 结论

1）单因素分析有机溶剂萃取丁香精油试验显示：最优的有机溶剂为正己烷、萃取温度、80 ℃、颗粒度110 目、料液比：1 ∶15（g/mL）。

2）有机溶剂萃取丁香精油U6（64）分析试验中显示：有机溶剂选用正己烷、萃取温度：80 ℃、颗粒度110 目、料液比：1 ∶15（g/mL）为较优工艺条件。最优工艺条件下丁香精油的收率为22.98%，丁香精油主要成分及含量：丁香酚13.27%、β-石竹烯1.26%和乙酰基丁香酚1.15%。

3）丁香油对青霉菌、浆胞的最小抑菌浓度为：2.0 μL/mL 和 2.5 μL/mL。

4）丁香精油活性成分中，乙酰丁香酚的抑菌活性大于丁香酚，350 mg/L 的丁香酚和300 mg/L 乙酰基丁香酚可完全抑制青霉菌的生长，β-石竹烯对青霉没有抑制效应。