铁皮石斛组织培养工厂化育苗及原生态栽培技术研究

谢腾飞，张华通，何旭君，赖增哲，李慧钗，赵静

（广东生态工程职业学院，广东 广州 510520）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属类植物，种类繁多，广泛分布在亚洲、欧洲、澳洲等地区[1]，在我国主要分布于广西、广东、福建、四川、浙江、云南和贵州等西南和华南地区。野生铁皮石斛为附生性多年生兰科植物，主要生长在温度湿润、半阴湿的岩石上或者疏林中的树干上，对生态环境要求苛刻，生长温度为20～26℃，空气湿度要求需要达到70%～85%。据《中国药典》版记载，铁皮石斛归胃、肾经；益胃生津，滋阴清热。铁皮石斛用于治疗不明发热、口干舌燥、目暗不明、阴虚火旺、阴伤津亏、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、筋骨无力等病症，是传统的保健中药材之一[2-3]。

由于野生铁皮石斛资源较为稀缺，加上人们对野生资源的过度采挖，从而导致有些品种已濒临灭绝。[4-6]目前，铁皮石斛产业都注重于种植技术的研发和规模的扩大，而组织培养工厂化育苗是一种人工栽培非常重要的育苗方式[7]。研究结果表明，种龄、灭菌方式、外植体选择、接种密度、继代周期、培养基配方、移苗方式等诸多关键技术对铁皮石斛组织培养快繁效果影响很大[8-9]。据宋爽等[10]报道，不同的栽培技术对铁皮石斛的质量具有明显的影响，其中以野生资源的铁皮石斛质量最佳。因此，大力开展原生态栽培技术研究与推广是提高铁皮石斛质量的一种有效途径。

本研究基于铁皮石斛的组织培养工厂化育苗关键技术研究，对工厂化生产育苗工艺流程进行优化，探索试管苗移植栽培管理技术，以求建立适用于生产的优质铁皮石斛种苗快速繁育体系，并通过原生态栽培种植，探索仿野生铁皮石斛适宜生长条件，为提高铁皮石斛仿野生种植效益提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用铁皮石斛由广东生态工程职业学院生物技术综合实训基地提供的组织培养苗。

1.2 试验方法

1.2.1 铁皮石斛无菌播种工厂化生产育苗简易工艺流程 外植体主要采用优质种果，无菌条件下取种子进行培养；采用MS 培养基，附加细胞生长素NAA0.1～0.6mg/L 和马铃薯 20～50g/L 及苹果泥 20～50g/L。并在无菌条件下，进行铁皮石斛的无菌播种及组织培养继代增殖。无菌播种发芽培养及初代培养其培养温度为25±2℃，光照时间为10～12h，强度控制在2000～3 000lx。经90 d 左右培养即可萌发出大量的小苗。以后均采用同一培养基，每90 d 转接1 次，连续转接2 次，小苗嫩茎长到3 cm 左右，根系完整即可进行炼苗移栽。

1.2.2 试管生根苗处理 经培养室壮苗生根培养约30 d 的小苗置于塑料大棚进行炼苗，经生根炼苗60 d 后，选择苗高3～5cm、生长正常、长势较好的试管生根苗。用镊子轻轻地夹出炼好的试管生根苗，置于装有干净自来水的塑料盆里，清洗2 遍，以洗净培养基。并用0.01%的高锰酸钾溶液浸泡5min，自来水清洗，甲基托布津水溶液浸泡2 min。

1.2.3 试管生根苗种植及栽培管理 试管生根苗在清洗消毒后，栽植于遮阳网垫底，长 宽 高为50 40 7cm，排水良好的塑料筛中。种植时，用手轻捏，使试管生根苗的根部与基质充分接触。种植后，放在有遮阴的标准塑料大棚进行栽培管理。最初2 d 内不用浇水，第3 天开始淋第1 次促根杀菌营养液（翠筠B1 营养剂+多菌灵+磷酸二氢钾溶液），以后每10 d喷施该溶液1 次并保持种植基质经常处于湿润状态。与此同时，需要防治病虫害。

1.2.4 不同方法处理铁皮石斛试管苗移植对比试验本试验对试管苗消毒后进行2 个对比处理，分别为消毒后晾苗2 d 后种植（水珠干透、根系变白）和洗苗消毒后直接种植，并记录移植60 d 后的生长情况。

1.2.5 移栽培养基质筛选试验 单一移栽基质筛选：本试验采用松树皮、木屑、苔藓、泥炭土、红火山岩等5个处理，对移植60 d 后试管生根苗的生长情况进行观察分析。

混合移栽基质筛选：本试验移栽基质设计为J1（木屑∶松树皮=3∶2）、J2（木屑∶陶粒=3∶2)、J3（苔藓∶小石粒=3∶2）、J4（泥炭土∶陶粒 3∶2）、J5（红火山岩∶小石粒3∶2）、J6（松树皮∶红火山岩3∶2）6 个处理，记录移植60 d 后的生长情况。

1.2.6 不同季节栽培对比试验 本试验设计为春（3～5月）、夏（6～8 月）、秋（9～11 月）、冬（12～2 月）4 个季节对驯化苗移栽成活及生长情况的影响。栽培基质为J6（松树皮∶红火山岩3∶2），采用3 寸盆种植。移栽后，记录栽培苗的生长情况。

1.2.7 铁皮石斛的原生态栽培方式对比试验 本试验采用枯立木附生种植、吊篮种植和活树体附生种植3个对比处理。枯立木附生种植选择直径为15 cm 左右的原木，置于光线充足、遮阴树下光照通透的位置，在原木皮层按株距20 cm 的密度种植，用少量苔藓包裹后贴于树皮上，再用麻绳绑紧固定，根系要求自然伸展；吊篮挂在树枝上，保持吊篮处透光较足，且避免强光直接照射；活树体附生种植选择附生树中光线充足、通透的枝干部位，按株距20 cm的密度种植，用少量苔藓包裹后贴于树皮上，再用麻绳绑紧固定，根系要求自然伸展；种苗规格为铁皮石斛组织培养驯化苗达到主茎长6 cm 以上，辅茎长4 cm 以上；主茎粗0.4 cm 以上，辅茎粗0.1 cm以上。记录附生及种植后的生长情况。

2 结果与分析

2.1 工厂化生产育苗简易工艺流程获得铁皮石斛组培苗

本实验室通过对种子消毒，严谨的无菌操作及良好的诱导、壮苗培养基等技术的研究，探索出了铁皮石斛无菌播种工厂化生产育苗简易工艺流程：铁皮石斛荚果外植体消毒→种子无菌发芽培养→无菌小苗转接增殖培养→塑料大棚生根炼苗→试管生根苗种植。整个过程只采用一种培养基为MS+NAA（0.1～0.6 mg/L）+马铃薯泥（20～50g/L）+苹果泥（20～50g/L）+蔗糖（30g/L）。利用这一技术培育出大量的铁皮石斛优质种苗，以满足后续试验及生产的需求（图1）。

图1 铁皮石斛工厂化组培苗Fig.1 Tissue culture seedlings of D.otticinale

2.2 不同方法处理铁皮石斛试管苗移植结果

对比试管苗消毒后晾苗2 d 后种植（使附苗上无水珠、根系变白）和洗苗消毒后直接种植〔移栽基质均采用J1（木屑∶松树皮=3∶2）〕，移植于标准塑料大棚进行栽培管理，期间对移植后试管苗根、苗的生长状况及移植成活率进行观察记录，并在60 d 后统计其移栽成活率。从表1 中可得出，铁皮石斛试管苗经晾苗处理后，平均移栽成活率达到95.0%，明显优于试管苗直接种植的72%成活率；根和苗生长比较结果，试管苗经晾苗处理后8 d 左右可以长出新根，而直接种植的试管苗要在14 d 后才能长新根，新根长度较短，较为严重的是，有些根出现腐烂情况；经晾苗处理后的试管苗在大概10 d能长出新叶，而直接种植的试管苗长势较差，并部分苗出现腐烂。因此，可以得出晾苗处理有利于铁皮石斛试管苗移植生长。

2.3 移栽培养基质筛选试验结果

为了解单一移栽基质在铁皮石斛试管苗移植培养中的效果，通过采用松树皮、木屑、苔藓、泥炭土、红火山岩等5 种基质进行栽培，期间对移栽后试管苗的生长状况及移植成活率进行观察记录，并统计其移栽成活率，结果（见表2）显示，单一基质的培养中，松树皮基质培养的效果最好，成活率达到89.5%，而在泥炭土中，培养成活率只有32.1%；试管苗在松树皮、木屑中生根较为理想，在苔藓、泥炭土及红火山岩基质中，根长势很差，根细且短，还出现部分腐烂现象。

表1 铁皮石斛试管苗移植中不同处理方法的对比试验Table 1 Different treatment methods in D.otticinaletube seedling transplantation

在采用不同混合基质培养铁皮石斛试管苗移栽的结果显示，在J1、J2 和J6 这三种混合基质中，成活率达到90%以上，在J4 和J5 中的成活率较低，分别为68.0%、76.0%。在成活率较高的三种混合基质中，我们也发现在一个星期内可以长出新根，根系发达，根长且较粗壮。而J4 和J5 基质根长势差，很细弱。苗的新芽萌发及叶片增加的速度在J1、J2 和J6 混合基质中明显优于成活率较低的混合基质。本试验结果表明，以J6 为基质栽培效果最好，而且也符合经济原则（见表3）。

表2 铁皮石斛试管苗移植中不同单一移栽基质中的种植对比试验Table 2 Different single transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation

表3 铁皮石斛试管苗移植中不同混合移栽基质中的种植对比试验Table 3 Different mixed transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation

2.4 铁皮石斛不同季节栽培对比试验结果

为了解铁皮石斛试管苗在不同季节移植栽培的效果，我们进行了春夏秋冬的移植对比，结果（见表4）显示，春季和秋季的栽培效果最好，成活率高达92.0%和96.0%，而夏季和冬季栽培效果不理想。虽然秋季成活率较高，但试验发现，其根系发育速度明显落后于春季（长根时间分别为20 d 和58 d）。在冬季，铁皮石斛移栽成活率仅为26.5%，未见新根有明显变化。苗的生长情况也存在相同趋势，春天移栽的试管苗生长快。其次为秋季、夏季。而冬季苗未见长高，只是茎稍有长粗。试验结果表明春季是铁皮石斛栽培种植的最佳选择，秋冬季时生长缓慢，尤其是冬季，不适宜栽培种植铁皮石斛。

2.5 铁皮石斛的原生态栽培方式对比试验结果

由于铁皮石斛主要在野外附生性生长，为保证铁皮石斛的价值，需要采用原生态的栽培方式（图2）。本试验中，我们采用了枯立木附生种植、吊篮种植和活树体附生种植这三种原生态的栽培方式。结果显示吊篮种植的成活率最高，高达95.0%，其次为活树体附生种植（89.5%），枯立木附生种植（85.5%）。而且吊篮种植的根系生长也是最快的，但活树体附生种植的根系最为发达，可以和活体树皮相互紧密缠绕。苗的生长速度差别不大。本试验表明，在原生态栽培过程中，吊篮种植的生长情况最好，但也发现活树体附生种植铁皮石斛的效果也不错（表5）。

图2 铁皮石斛的原生态栽培Fig.2 Ecological cultivation of D.otticinale

3 讨论与结论

铁皮石斛为多年生附生兰的草本植物，在野外状态下，铁皮石斛种子繁殖力低，在发芽率、萌发、生长，及开花的铁皮石斛结实率也很低[11]，这些原因导致其有性生殖的自然繁殖率低。而需求量的快速增加，加急了铁皮石斛的稀缺。因此，随着组织培养技术的发展，利用组织培养的种苗，并采用人工大规模种植的铁皮石斛是市场上产品的主要来源[12]。本实训中心主要以组织培养技术研究为主，培养了菊花、金叉石斛和迷迭香等多种经济植物[13-14]，有一套非常完善的组织培养及工厂化育苗的技术。通过不断摸索，已经建立了一套成熟的铁皮石斛组培方法，并能进行工厂化生产育苗，该技术成活率高、可产出高质量苗。在此期间，我们发现试管生根苗移栽过程处理是铁皮石斛组培成功运用于生产的重要步骤，因此对此进行了详细的研究。与此同时，本研究还尝试了不同的原生态种植方法，以求获得高质量的铁皮石斛鲜条，满足市场需求。

获得能够移栽到田间的铁皮石斛苗是繁育技术的核心问题，因此需要保证移栽的成活率。杨大赞报道认为在试管苗清洗时，根茎都很脆弱，易受到真菌感染，最好进行根系的脱水处理[15]。本试验结果证明了这个观点，通过比较晾苗2 d后种植和直接种植处理，晾苗后成活率明显较高；根的生长良好，苗长叶及发育也快，而直接种植的试管苗的根会出现腐烂现象，这应该是跟真菌感染有关，而芽的长势也比较差。本研究表明采用洗苗消毒后晾苗2 d的处理方法，有助于铁皮石斛试管苗的移植生长。

培养基质对植物的影响是显而易见的，在选择植物培养基质时，需要结合实际生长情况，从而保证成活率和生长态势。一般认为，不同种类的微生物会附生在野生的铁皮石斛根系中，从而分解土壤中的有机物。因此，人工基质很难达到自然的效果。因此，会选择碎石子、泥炭土、火山岩和木屑等作为培养基质。有研究报道木屑、泥炭土的保水能力较好质，椰子丝、松树皮可以增加基质的透气性，不同基质的混合使用不仅可以满足基质保水需求，还可以改善基质的透气[16]。本试验显示单一基质最高的成活率仅为 89.5%（松树皮），大部分单一基质中的成活率都较低。松树皮+红火山岩（3∶2）为混合基质栽培时，成活率最高，根的长势也是最好。在单一基质如泥炭土、红火山岩中，铁皮石斛根系还发生了部分腐烂现象。由此，本研究得出的试管生根苗最佳移栽基质为木屑+松树皮，既有较好的保水能力，还能透气。

由于光照、温度和水分对铁皮石斛的生长有重要作用[17-18]，因此，不同栽植季节对铁皮石斛生长的影响也是显而易见的。通过对福建地区铁皮石斛种植的季节影响进行探索，结果显示，铁皮石斛在春、秋、夏季其单丛鲜重、萌芽数生长有极显著差异，以春季栽植为优，秋季则次之，秋季栽植则应做好抗寒防冻工作[19]。在广东，我们也发现了相同的趋势。在夏季，可能由于温度太高，铁皮石斛的成活率和长势都不好。而冬季是铁皮石斛营养积累的时期，加之温度过低，其栽培成活率非常低。本研究得出春季是铁皮石斛栽培种植的最佳季节。

环境因子会使植物表型及生理生态特性产生不同的变化[20]。铁皮石斛的组培苗、大棚栽培植株及野生植株营养成分比较发现，野生栽培铁皮石斛的多糖含量高于人工栽培的铁皮石斛，还有人工栽培铁皮石斛所含微量元素低于野生栽培[21]。而且，采用树皮等仿生基质有助于提高铁皮石斛的蛋白质和多糖等营养物质的积累。因此，原生态种植是铁皮石斛栽培的重要方式。目前报道的原生态种植主要采用活树体附生种植。崔之益等[22]分别采用降香黄檀、马占相思、龙眼、杨桃等进行铁皮石斛附生种植，结果显示，其生长的茎粗细、长短及生物产量与其植株高度呈显著性相关。枯立木附生种植和吊篮种植的研究较少，主要适用于树木不多的林地种植。本研究发现吊篮种植中铁皮石斛的成活率及根苗长势最好，这可能与而其远离地面种植，生长空间大，光环境和通风环境均优于其它原生态栽培方式，能有效促进铁皮石斛生长。本试验结果说明，除活树体附生种植外，吊篮种植也是一种比较好的种植栽培模式选择。枯立木附生种植虽比活立木种植、吊篮种植表现稍差，但采用活立木种植和吊篮种植结合进行，可以充分利用空间，大大提高了单位面积铁皮石斛的鲜条产量。

试管苗的移栽是铁皮石斛组织培养工厂化育苗中的一个关键环节。由于试管苗始终处于一个相对稳定的无菌环境下，对外界自然环境的适应性其是否移植成功决定影响试管苗移栽成败因素包括驯化苗的选择、栽培基质的选择和温度湿度光照等。本研究以组培生根的铁皮石斛试管苗为材料，通过试验，证明了铁皮石斛试管苗移植过程中，通过晾晒2 d 处理有助于提高移植是成活率；最优的基质为松树皮+红火山岩（3∶2）混合，是生产容易推广的材料，具有潜在的经济效益。栽培试验结果显示，种植栽培的季节应当以春季为优，气温适宜，空气湿度大。秋季应做好抗寒防冻工作。夏季和冬季由于气候，不利于铁皮石斛生长。原生态栽培对比证明吊篮种植是除活树体附生种植外的理想方式。这为寻找铁皮石斛组培工厂化育苗寻找更为高效的移栽方法，及大面积推广原生态铁皮石斛栽培提供技术参考。