貉胆生药学鉴定研究

李炎桂，臧埔，曲正义，王玉方，王凯，李滋睿，郜玉钢，徐超※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.吉林农业大学，吉林 长春 130118；3.辽宁千山旅游集团有限公司，辽宁 鞍山 114001）

熊胆为熊科动物黑熊的胆汁干燥品，是我国传统名贵动物药材，有1 300 多年的医药学应用历史，历代中医古籍中含熊胆的方剂多达396 首[1]。熊胆初次记载于《新修本草》，气味苦寒、无毒，入肝胆心经。现代药理学实验表明，熊胆具有保肝利胆、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等药理作用[2-4]。但是熊胆的资源极其短缺，其研究和应用受到严重障碍。因此，寻找熊胆替代品中药材新资源，开展其临床前研究具有重要的社会、经济及生态意义。由于熊胆粉来源的限制，因此寻找替代品首先要考虑其来源是否广泛和充足。貉是皮毛动物养殖品种中最容易饲养的品种。我国2017年产貉皮1 240万张[5]，打皮后的尸体多被整只废弃，就是说每年都有1 240万个貉胆胆囊被丢弃。貉和黑熊都是杂食性动物[6-7]，二者的亲缘关系较近、食性接近，能否将貉胆变废为宝，代替熊胆，有待于进一步研究。本文通过来源鉴定、性状鉴定[8]、显微鉴定[9-10]、理化鉴定[8,11-12]等方法对貉胆进行鉴别，比较貉胆和熊胆之间的异同点；通过对比分析貉胆粉和熊胆粉的异同，以期为貉胆质量制定标准，为貉胆的药用提供理论依据，也为貉胆粉替代熊胆粉是否可行提供理论依据和参考。

1 试验材料与仪器

1.1 样品来源

貉胆取自犬科动物貉（Nyctereutes procyonoids）的新鲜胆囊、胆汁及其干燥品，貉选自中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地。熊胆购于四川养麝所，为熊科动物黑熊（Selenarctors thibetanus）的引流胆汁干燥品。

1.2 试验仪器

DZF-6050 真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；显微镜及显微成像系统（奥林巴斯株式会社），载玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；XP504 梅特勒精密天平〔梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司〕；ZF-20D暗箱式紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；HH-2 数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；HI-9124 便携式防水型酸度测量仪〔哈纳沃德仪器（北京）有限公司〕；UP400S立式超声波处理器（上海桂宁实验器材有限公司）；S22H 超声波清洗机（厦门致微仪器有限公司）；GZX-9146MBE 电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；层析硅胶（G）-薄板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

1.3 试验材料与试剂

胆酸标准品（AC，E612BA0018）、去氧胆酸标准品（DCA，DA24BA0024，含量为99%）、熊去氧胆酸标准品（UDCA，BB07BA0324）、鹅去氧胆酸标准品（CDCA，E222BA0006）〔生物工程（上海）股份有限公司〕；盐酸（优级纯）、氢氧化钠、乙醇、硫酸、冰醋酸、氯仿、甲苯（分析纯，北京化工厂）；乙酸乙酯（分析纯，太仓沪试试剂有限公司）；异辛烷（分析纯，天津永晟精细化工有限公司）；无水乙醚（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；正丁醇（分析纯，天津新通精细化工有限公司）；丙酮（分析纯，长春市化学试剂厂）；甲醇（分析纯，国药集团公司）。

2 试验方法

2.1 来源鉴定

分别对2 种动物胆基源进行考察，确定源头。

2.2 性状鉴定

分别对两种动物胆进行感官鉴定，通过眼看、口尝、鼻闻、水试、火试等方法，比较貉胆和熊胆的差异。

2.3 显微鉴定

分别取少量貉胆粉末及熊胆粉末，放置在载玻片中央，滴加2～3 滴甲苯，使用解剖针搅拌均匀，自然挥干。

2.4 理化鉴定

2.4.1 荧光反应 分别取貉胆粉末和熊胆粉末少许，将其置于载玻片上，移载玻片至暗箱式紫外分析仪中，于紫外光362 nm 下观察。

2.4.2 薄层层析

标准品溶液与供试品溶液制备 分别精准称取胆酸、去氧胆酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸标准品3 mg，移至10 mL 离心管，分别添加6 mL 乙醇，制成浓度为0.5 mg/mL 的标准品溶液。

分别精密称取貉胆粉和熊胆粉各50 mg，分别置于具塞试管中，加入10%NaOH 溶液5 mL，在冰水中进行超声溶解。将溶解的样品，放入干燥箱120 ℃，加热水解2h 后，取出放冷，滴加HCl 调节pH 值至2～3。所得样品溶液分别用醋酸乙酯振摇萃取2次，每次10mL，分别合并上层醋酸乙酯液。置水浴锅中55 ℃水浴挥发至干后，添加少量乙醇至蒸发皿中，溶解残渣，移至5 mL容量瓶，添加乙醇稀释至刻度，摇匀，即获得貉胆和熊胆供试品溶液。

展开剂的配制 按异辛烷∶无水乙醚∶冰醋酸∶正丁醇∶水=10∶5∶5∶3∶1 比例配置展开剂，混匀后，置于分液漏斗中，静置60 min后，取上层溶液备用，作为展开剂（现用现配）。

数据读取与统计 使用毛细管吸取上述样品和标准品，分别点在同一硅胶（G）板上，挥干。重复1 次即可。以现配的展开剂展开，展开剂延伸至薄层板上端1 cm 处时取出，晾干。喷洒10%硫酸溶液，于105 ℃烘约1 min，显色清晰即可取出，分别在自然光和紫外光365 nm 条件下观察。记录原点至各组分斑点中心的距离和原点至溶剂前沿的距离，计算比移值Rf。

3 结果与分析

3.1 来源鉴定结果与分析

貉胆胆囊和胆汁来源动物经鉴定为犬科动物貉。

3.2 性状鉴定结果与分析

貉胆胆囊干燥后呈扁卵形，上部狭细，下部膨大呈囊状，中部半透明，呈黄棕色，下部颜色逐渐加深，黄棕色至黑色不透明，有光泽，褶皱，囊皮较薄、质坚。干燥胆囊长2.9～5.5 cm，宽1.3～2.1 cm，重0.9～2.3 g，单个胆含胆汁3～5 mL，个别可达10 mL。如图1A。

貉胆汁呈棕黄色，干燥后的貉胆片脆，有光泽，半透明，如图1B；貉胆片断面光滑，有光泽；粉末黄色或黄绿色，味苦回甜，有明显腥气，如图2A；火试发现貉胆片起油泡较小，有腥气；水试发现貉胆片在水面缓慢移动，在水表面和器底均有明显黄绿色扩散迹象，溶解的貉胆呈黄色或黄绿色线状下沉；貉胆片在水中溶解速度比熊胆片快。熊胆片较脆，半透明，粉末黄棕色，有清香味，腥气较淡不明显，熊胆断面粗糙，光泽较貉胆弱，如图2B；熊胆味极苦回甜；火试熊胆片有明显油泡，有烧焦头发的味道；水试发现熊胆片在水面移动缓慢，在水面和器底均无明显扩散迹象，溶解的熊胆呈黄色线状下沉。

图1 貉胆干燥品Fig.1 Dried bile of raccoon dog

图2 胆粉Fig.2 Bile powder

3.3 显微鉴定结果与分析

在显微镜下观察，貉胆粉末有结晶存在，多呈无色或黄色，透明或半透明晶体，棱角分明，有明显条纹，少数为黑色不透明，粉末聚集处有团块，可能是貉胆粉末分散不彻底导致的，稀释后，团块减少，如图3A。熊胆粉末多呈黄棕色半透明晶体或黑色不透明，有时可见条纹，不清晰，如图3B。

3.4 理化鉴定结果与分析

3.4.1 荧光反应 发现貉胆粉末在紫外光下有明亮黄绿色荧光，熊胆粉末在紫外光下有黄白色荧光，如图4所示。

图3 粉末显微鉴定Fig.3 Powder microscopic Identification

3.4.2 薄层层析 展开剂展开并显色后，计算标准品胆酸（CA）、去氧胆酸（DCA）、熊去氧胆酸（UDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）对应的比移值Rf，分别是Rf1=0.24，Rf2=0.47，Rf3=0.36，Rf4=0.41。

图4 紫外光条件下的胆粉Fig.4 Bile powder under ultraviolet light

如图5，自然光条件下可观察到，貉胆样品（栏5）中分别对应标准品1、2、4 的位置有物质存在，明显含有大量的物质1，即胆酸，貉胆样品中对应标准品2 和4 位置的物质相连，未分开，但是自然光下貉胆样品对应位置上下颜色差异明显，上部分颜色同标准品2 接近，下部分颜色同4 接近，可用确定貉胆粉应含有2 和4，即去氧胆酸和鹅去氧胆酸。熊胆样品（栏6）中分别对应标准品1、3、4 的位置有物质存在，其中对应标准品1 的物质已分离，可以确定含有少量的胆酸，对应标准品3 或者4 的位置未分离，且颜色相似，即可能代表熊去氧胆酸，也可能代表鹅去氧胆酸。紫外光灯365nm条件下，可以发现标准品2 对应标准品1 的位置有相应微弱荧光，说明该标准品不纯，含有少量的胆酸。

上述实验说明貉胆和熊胆均存在相同物质胆酸，可能含有相同物质鹅去氧胆酸。

图5 TLC 图谱Fig.5 TLC graph

4 讨论与结论

现今，未见关于貉胆的生药学鉴定研究，也未见貉胆粉替代熊胆粉相关报道。本研究通过传统鉴定方法明确貉胆粉和熊胆粉的异同。为以后貉胆粉应用确立标准，为替代熊胆粉研究提供理论基础。

貉胆粉来源于犬科动物貉的干燥胆汁，极容易获取。貉胆干燥胆囊上部狭细，下部膨大呈囊状，黄棕色至黑色，囊皮较薄褶皱，质坚；貉胆汁黑绿色或黄绿色，有泡沫；貉胆胆仁脆，半透明，表面有光泽，断面光滑，光泽明显；粉末黄色、黄绿色，有腥气。显微镜下貉胆粉末存在结晶，无色至黄色，半透明或透明，有明显棱角，条纹明显，紫外光下，貉胆粉末有明亮黄绿色荧光。熊胆胆仁较脆，半透明，断面较粗糙，光泽较弱，粉末黄棕色，腥气不明显，较淡。显微镜下熊胆粉末多呈黄棕色半透明或黑色不透明晶体，有时可见条纹，不清晰；紫外光下，熊胆粉末有黄白色荧光。此外，貉胆片较熊胆片更容易溶于水，貉胆中水溶性成分含量应较熊胆中多。通过TLC 实验，发现貉胆粉含有CA，可能含有DCA 和CDCA。可以确定貉胆粉含有熊胆粉中功效性成分CA，具体所含胆汁酸种类有待进一步研究。功效上是否具有一定相似性，是否能替代熊胆粉入药，有待进一步研究。